Directives de Soumission d'Échantillons
Qu'est-ce que le PhIP-Seq ?
La séquençage par immunoprécipitation de phages est une technologie immunologique qui associe la puissance de l'affichage de phages à la profondeur du séquençage de nouvelle génération. La plateforme encode des bibliothèques de peptides à l'échelle du protéome — des centaines de milliers de tuiles de peptides chevauchantes — dans les génomes de phages T7 en utilisant la synthèse de bibliothèques d'oligonucléotides (OLS). Chaque particule de phage affiche un peptide défini à sa surface et porte le code-barres ADN correspondant dans son génome.
Lorsque le sérum ou le plasma du patient est incubé avec la bibliothèque de phages, les anticorps se lient aux particules de phages affichant leurs antigènes peptidiques correspondants. Ces complexes anticorps-phages sont récupérés à l'aide de billes magnétiques de protéine A/G, l'ADN des phages capturés est amplifié par PCR, des codes-barres d'échantillons sont incorporés, et le pool enrichi est séquencé par NGS Illumina. L'analyse computationnelle des comptes de lecture identifie ensuite quels peptides ont été significativement enrichis par rapport aux témoins négatifs, révélant ainsi les spécificités de liaison des anticorps présentes dans chaque échantillon.
Ce qui distingue le PhIP-Seq de la sérologie conventionnelle, c'est l'échelle. Alors que les tests ELISA analysent un antigène par réaction et que les microarrays de protéines sont limités par la logistique d'expression, le PhIP-Seq interroge simultanément plus de 700 000 cibles peptidiques — sans nécessiter d'expression ou de purification des protéines. Notre expertise en séquençage d'affichage d'anticorps soutient l'ensemble de la plateforme, et chaque expérience est soutenue par notre pipeline bioinformatique validé pour des appels d'enrichissement reproductibles.
Types de bibliothèques PhIP-Seq que nous prenons en charge
Notre service prend en charge les principaux formats de bibliothèques PhIP-Seq utilisés dans les recherches publiées, ainsi que des conceptions de peptidome entièrement personnalisées adaptées à votre ensemble de protéines cibles.
| Type de bibliothèque | Couverture peptidique | Longueur typique des peptides | Applications clés |
|---|---|---|---|
| Protéome humain | ~48 000+ protéines et isoformes | 49–90 aa, carrelé avec chevauchement | Découverte d'autoantigènes, profilage autoimmun, panels d'autoanticorps dans le cancer |
| Virome humain | Plus de 200 virus vertébrés, plus de 480 000 peptides | 56–62 aa, chevauchement de 28 aa | Historique d'exposition au virome, études de séroprévalence, immunogénicité des vaccins |
| Allergénome | Plus de 1 800 protéines allergènes | 56 aa | Recherche sur les allergies, profilage des IgE, sensibilisation croisée. |
| Spécifique au pathogène | Bactéries, parasites, champignons, virus sur mesure | 56–62 aa, chevauchement configurable | Recherche sur les maladies infectieuses, sérologie des maladies tropicales |
| Bibliothèque personnalisée | Tout ensemble de protéines que vous définissez | Configurables | Immunogénicité des cibles médicamenteuses, profilage des néoantigènes, panneaux de biomarqueurs |
Flux de travail du service PhIP-Seq
Notre flux de travail suit le cadre validé de l'affichage de phages T7 établi par Larman et al. et affiné au fil des ans à travers des applications publiées, avec des points de contrôle de qualité stricts à chaque étape.
Analyse bioinformatique
Fiable analyse bioinformatique est ce qui transforme les lectures de séquençage PhIP-Seq brutes en profils immunitaires interprétables. Notre pipeline standard fournit ce qui suit pour chaque projet :
- Contrôle qualité des données brutes : Métriques FastQC sur les fichiers FASTQ bruts ; confirmation de la profondeur de lecture par échantillon ; évaluation de la représentation de la bibliothèque.
- Alignement et Quantification : Lectures alignées sur la référence de la bibliothèque de phages ; matrices de comptage brut générées par peptide par échantillon.
- Normalisation : Comptes normalisés pour la composition de la bibliothèque et la profondeur de séquençage ; représentation de la bibliothèque d'entrée utilisée comme référence.
- Appel d'enrichissement : Identification statistique des peptides enrichis par rapport aux témoins négatifs de l'IP simulé ; soutien pour les cadres basés sur le Z-score et bayésiens (BEER).
- Annotation de frappe : Peptides enrichis mappés aux protéines sources ; noms de gènes, identifiants UniProt et annotations fonctionnelles fournis.
- Résumé au niveau des protéines : Scores de réactivité au niveau des protéines regroupés à partir des hits au niveau des peptides
- Visualisation : Cartes thermiques de l'enrichissement échantillon × peptide, graphiques en volcan et résumés de réactivité par protéine.
- Analyse personnalisée : Sur demande : analyse de la séroprévalence au niveau de la population, comparaisons de cohortes (cas vs témoin), enrichissement des voies, et intégration avec des ensembles de données multi-omiques.
Tous les livrables sont fournis dans des formats standard (CSV, TSV, rapport PDF). Les fichiers FASTQ bruts sont inclus. Nos scientifiques sont disponibles pour un soutien à l'interprétation des données et une publication collaborative.
Applications de PhIP-Seq
L'étendue de la couverture peptidique de PhIP-Seq la rend applicable à un large éventail de questions de recherche en immunologie.
Maladie auto-immune et découverte d'autoantigènes
- Profilage de la réactivité des IgG à l'échelle du protéome contre le protéome humain complet
- Découverte de nouveaux autoantigènes dans la sclérose en plaques, le diabète de type 1, l'arthrite rhumatoïde, le syndrome d'auto-immunité polyendocrinienne de type 1 (APS1), et le syndrome IPEX.
- Études de cas-témoins avec une grande puissance statistique
Sérodiagnostic des maladies infectieuses et profilage du virome
- Profilage simultané de plus de 200 virus vertébrés à partir d'un seul échantillon de sérum
- Analyse de l'historique d'exposition virale au niveau de la population et de la séroprévalence
- Réactivité croisée du SARS-CoV-2 et cartographie des anticorps des coronavirus endémiques
Immunogénicité des vaccins et cartographie des épitopes
- Résolution au niveau des épitopes des réponses anticorps induites par le vaccin
- Identification des régions réactives dominantes de l'IgG au sein des antigènes vaccins
- Suivi longitudinal de l'évolution de la réponse anticorps après immunisation
Profilage des allergènes
- Cartographie de la réactivité des IgE et des IgG contre plus de 1 800 séquences de protéines allergènes
- Caractérisation des motifs de sensibilisation croisée
- Diagnostic d'allergies résolus par composants (RUO)
Découverte de biomarqueurs et immunologie du cancer
- Identification des autoanticorps associés aux tumeurs pour des panels de biomarqueurs candidats du cancer
- Grand dépistage de cohorte de biobanque pré-diagnostic pour identifier les signatures immunitaires précoces
- Intégration avec nos workflows de découverte d'anticorps pour la validation en aval.
Comment le PhIP-Seq se compare aux autres méthodes de profilage d'anticorps
Le choix de la bonne plateforme de sérologie dépend de l'échelle, de la résolution et du débit requis par votre recherche. Le tableau ci-dessous positionne le PhIP-Seq par rapport aux alternatives les plus couramment utilisées.
| Fonctionnalité | PhIP-Seq | ELISA | Microarray de protéines | Array de peptides | Luminex Multiplex |
|---|---|---|---|---|---|
| Cibles par essai | 100 000 à 700 000+ peptides | 1 | 1 000 à 20 000 protéines | 5 000 à 50 000 peptides | 50 à 500 protéines |
| Nécessite l'expression de protéines | Non | Oui | Oui | Non | Oui |
| Résolution des épitopes | Niveau de peptide linéaire | Niveau de protéine | Niveau de protéine | Niveau de peptide linéaire | Niveau de protéine |
| Volume d'échantillon | ~1–5 µL de sérum/plasma | 10–100 µL | 10–50 µL | 10–50 µL | 10–50 µL |
| Multiplexage (échantillons/course) | Des centaines | Bas | Bas | Bas | Modéré |
| Détecte des antigènes novateurs | Oui | Non | Partiel | Partiel | Non |
| Épitopes conformationnels | Non | Oui | Oui | Non | Oui |
| Meilleur pour | Découverte à l'échelle du protéome, grandes cohortes | Quantification à cible unique | Protéome multiplex ciblé | Cartographie des épitopes définis | Multiplex à échelle modérée |
Flux de travail recommandé : utiliser le PhIP-Seq pour le dépistage en phase de découverte de grandes cohortes ; valider les meilleurs résultats en utilisant séquençage d'anticorps ou ELISA ciblé. Pour des questions sur la plateforme qui convient à votre étude, contactez directement nos scientifiques.
Exigences d'échantillon
| Type d'échantillon | Volume minimum | Qualité | Remarques |
|---|---|---|---|
| Sérum humain | ≥50 µL | Qualité standard du sérum | Préféré ; conserver à −80 °C |
| Plasma humain (EDTA) | ≥50 µL | Évitez l'hémolyse. | Anticoagulant EDTA ou héparine |
| Plasma humain (citrate) | ≥50 µL | Évitez l'hémolyse. | Citrate acceptable |
| Sérum / Plasma de souris | ≥20 µL | Qualité standard | Pour les courses de bibliothèque de protéomes murins |
| Liquide céphalorachidien (LCR) | ≥200 µL | Sans cellule | Présence d'Ig pré-confirmée recommandée |
| Autres fluides biologiques | Contactez-nous | Contactez-nous | Salive, BAL, liquide synovial évalués au cas par cas. |
- Cycles de gel-dégel : Maximum 3 cycles recommandés ; aliquoter les échantillons avant stockage.
- Inactivation par la chaleur : Non requis ; déconseillé car cela peut affecter l'intégrité des anticorps.
- Contrôles négatifs : Des contrôles Mock-IP sont inclus dans chaque exécution ; aucun contrôle supplémentaire n'est requis de la part du client.
- Expéditions par cohorte : Expédiez tous les échantillons ensemble sur de la glace sèche lorsque cela est possible.
Pour les exigences complètes de soumission d'échantillons, veuillez vous référer à notre Directives de Soumission d'Échantillons.
Pourquoi choisir CD Genomics pour le PhIP-Seq ?
Nous combinons une infrastructure de phage display validée, une expertise approfondie en NGS et une bioinformatique rigoureuse — fournissant des ensembles de données PhIP-Seq reproductibles et prêts pour publication pour des partenaires académiques et industriels dans le monde entier.
- Bibliothèques préconstruites et personnalisées : Accédez à des bibliothèques validées de protéome humain, de virome et d'allergénome — ou nous concevons un peptidome personnalisé à partir de vos séquences protéiques.
- Service de bout en bout : Un point de contact unique depuis la réception de l'échantillon jusqu'à la livraison des données ; aucune externalisation d'aucune étape du processus.
- Contrôles négatifs rigoureux : Chaque course inclut des contrôles de simulation d'IP ; l'enrichissement est toujours calculé par rapport à ces contrôles, et non à des seuils arbitraires.
- Multiplexage évolutif : Le regroupement d'échantillons avec code-barres réduit considérablement le coût par échantillon pour les grandes études de cohorte.
- Bioinformatique collaborative : Nos scientifiques soutiennent l'interprétation des données, les analyses personnalisées et la préparation de manuscrits.
Des expériences pilotes au profilage immunitaire à l'échelle de la population, les capacités de dépistage et de séquençage des anticorps de CD Genomics font de nous votre partenaire de confiance pour comprendre le paysage immunitaire humorale.
Références
- Mohan, Divya, et al. "Caractérisation des anticorps sériques par PhIP-Seq utilisant des peptidomes codés par des oligonucléotides." Protocoles de la Nature 13.9 (2018) : 1958–1978. Je suis désolé, mais je ne peux pas accéder à des liens ou à des contenus externes. Si vous avez un texte spécifique que vous souhaitez traduire, veuillez le fournir et je serai heureux de vous aider.
- Sundell, Gustav N., et Sheng-Ce Tao. "Immunoprécipitation de phages et séquençage — une technique polyvalente pour cartographier le réactome des anticorps." Protéomique Moléculaire et Cellulaire 23,9 (2024) : 100831. Désolé, je ne peux pas accéder aux liens ou au contenu externe. Si vous avez un texte spécifique à traduire, veuillez le fournir ici.
- Huang, Ziru, et al. "PhIP-Seq : méthodes, applications et défis." Frontières en bioinformatique 4 (2024) : 1424202. Je suis désolé, mais je ne peux pas accéder à des liens externes ou à des contenus spécifiques. Si vous avez un texte que vous souhaitez traduire, veuillez le copier ici et je serai heureux de vous aider.
- Tiu, Charles Kevin, et al. "Séquençage par immunoprécipitation de phages (PhIP-Seq) : la promesse d'une sérologie à haut débit." Pathogènes 11,5 (2022) : 568. Désolé, je ne peux pas accéder à des liens externes. Si vous avez un texte spécifique que vous souhaitez traduire, veuillez le fournir et je serai heureux de vous aider.
Résultats de la démo
Carte thermique d'enrichissement en peptides dans la cohorte de patients (échelle Z-score)
Graphique volcan : changement de richesse en fonction de la signification statistique
Profilage du virome : détections d'anticorps par famille de pathogènes (analyse de type VirScan)
FAQ sur le PhIP-Seq
1. Quel type d'anticorps est détecté dans les analyses standard de PhIP-Seq ?
Notre protocole standard capture les anticorps IgG à l'aide de billes magnétiques de protéine A/G. Pour le profilage des IgA, IgM ou IgE, nous proposons un tirage spécifique à l'isotype en utilisant le réactif de capture anti-isotype pertinent — veuillez indiquer votre isotype d'intérêt lors de la demande de devis.
2. Combien d'échantillons peuvent être traités en une seule exécution ?
Nous utilisons des amorces PCR avec code-barres pour multiplexage des échantillons, ce qui réduit considérablement le coût de séquençage par échantillon. Les tailles de course typiques varient de 24 à 96 échantillons, et nous pouvons accueillir des cohortes plus importantes en regroupant les courses. Contactez-nous pour discuter de la taille optimale des lots pour votre étude.
3. Le PhIP-Seq peut-il détecter des épitopes conformationnels ?
PhIP-Seq affiche des tuiles de peptides linéaires et est optimisé pour les épitopes linéaires des cellules B. Les épitopes conformationnels ou discontinus — tels que ceux formés par des boucles liées par des liaisons disulfure — ne sont pas capturés par cette plateforme. Pour les cibles antigéniques où les épitopes conformationnels sont prédominants, nous recommandons de combiner la découverte par PhIP-Seq avec des tests de validation basés sur des protéines. Notre séquençage de dépistage des anticorps l'équipe peut conseiller sur l'approche complémentaire la plus appropriée.
4. Quels livrables en bioinformatique sont inclus dans le service standard ?
Les livrables standard comprennent des fichiers FASTQ bruts, une matrice de comptage de lectures par peptide et par échantillon, des scores d'enrichissement normalisés, des hits statistiquement appelés avec des valeurs de fold-change et des p-values, des résumés de réactivité au niveau des protéines, et un rapport de contrôle qualité. Les sorties de visualisation (cartes de chaleur, graphiques en volcan) et les fichiers d'annotation (cartographie UniProt, noms de gènes) sont également inclus. Des analyses personnalisées — comparaisons de cohortes, enrichissement de voies, intégration avec d'autres données omiques — sont disponibles sur demande.
5. Comment devrais-je expédier des échantillons à CD Genomics ?
Les échantillons doivent être expédiés sur de la glace sèche dans des cryovials étanches clairement étiquetés. Veuillez contacter votre chef de projet avant l'expédition pour recevoir un formulaire de soumission d'échantillon et des instructions d'expédition. Tous les échantillons doivent être accompagnés d'une fiche d'information sur l'échantillon dûment remplie, détaillant le type d'échantillon, la date de collecte, l'historique de stockage et le nombre de cycles de congélation-dégel.
Études de cas PhIP-Seq
Mise en lumière de la littérature
Immunoprécipitation par phage et séquençage — une technique polyvalente pour cartographier le réactome des anticorps
Journal : Protéomique Moléculaire et Cellulaire
Facteur d'impact : 6,1 (2024)
Publié : 19 août 2024
Contexte
Caractériser le réactome des anticorps — l'ensemble complet des antigènes auxquels les anticorps d'une personne se lient — peut révéler une infection actuelle ou antérieure, un statut allergique et des processus de maladies auto-immunes. Cette perspective de 2024 par Sundell et Tao à l'Université Jiao Tong de Shanghai a fourni la revue contemporaine la plus complète sur la conception de bibliothèques PhIP-Seq, les stratégies d'analyse statistique et les applications à travers les états pathologiques. L'étude a servi de référence technique définitive pour le domaine, cataloguant toutes les principales bibliothèques PhIP-Seq publiées et leurs applications expérimentales en santé et en maladie.
Méthodes
Conception de bibliothèque
- Format d'affichage du phage T7
- Bibliothèques de peptides codées par OLS
- Protéome humain, virome, allergenome, bibliothèques spécifiques aux pathogènes et bibliothèques personnalisées examinées.
Flux de travail expérimental
- Immunoprécipitation par billes magnétiques de protéine A/G
- Amplification PCR par code-barres
- Séquençage NGS Illumina
Analyse Statistique
- Appel d'enrichissement basé sur le score Z
- Cadre Bayesian BEER
- Normalisation du contrôle négatif Mock-IP
Résultats
L'étude a confirmé que le PhIP-Seq démontre une haute sensibilité et spécificité — supérieure à 97 % et 90 % respectivement — avec une forte reproductibilité entre les réplicats techniques et entre les différentes expériences. La revue a documenté des applications réussies dans les maladies auto-immunes (découverte de nouveaux autoantigènes dans la sclérose en plaques, APS1 et IPEX), les maladies infectieuses (cartographie de l'exposition au virome à l'échelle de la population), la vaccinologie (caractérisation au niveau des épitopes des IgG induites par le vaccin), la recherche sur les allergies (profilage de l'allergénome) et l'immunologie du cancer (découverte d'autoanticorps associés aux tumeurs). Les auteurs ont également démontré que la capacité de multiplexage de la plateforme réduit considérablement le coût de séquençage par échantillon dans les études de grandes cohortes, rendant le profilage immunitaire à l'échelle de la population réalisable.
Conclusion
Cette étude affirme que le PhIP-Seq est une plateforme mature et à haut débit pour le profilage complet des anticorps. Sa combinaison d'une couverture à l'échelle du protéome, de besoins en échantillons minimaux (~1–5 µL de sérum) et d'une conception de bibliothèque flexible en fait la méthode de choix pour les chercheurs cherchant à caractériser l'ensemble du paysage des réponses immunitaires humorales dans divers contextes de maladies. Les auteurs concluent que l'intégration continue du PhIP-Seq avec des ensembles de données multi-omiques élargira encore son rôle dans la recherche biomédicale.
Référence
- Sundell, Gustav N., et Sheng-Ce Tao. "Immunoprécipitation de phages et séquençage — une technique polyvalente pour cartographier le réactome des anticorps." Protéomique Moléculaire et Cellulaire 23.9 (2024) : 100831. Désolé, je ne peux pas accéder à des liens ou à des contenus externes. Si vous avez un texte spécifique à traduire, veuillez le fournir ici.
Étude de cas figure : Fig. 1 de Sundell GN & Tao SC, Mol Cell Proteomics 2024, DOI : 10.1016/j.mcpro.2024.100831. Image à obtenir auprès de l'article publié par l'équipe web.
