蛋白质组学技术大比拼：Astral-DIA为何脱颖而出？

蛋白质组学（Proteomics）是一门研究细胞、组织或生物体中全部蛋白质的组成、结构、功能、相互作用以及动态变化的科学，其意义在于全面解析蛋白质的表达、修饰和相互作用。蛋白质是生命活动的主要承担者，其动态变化直接反映生物体的生理和病理状态。通过蛋白质组学，可以深入理解细胞信号传导、代谢调控等复杂生物学过程，揭示生命活动的本质规律。在医学领域，蛋白质组学可发现疾病相关标志物，助力早期诊断和精准治疗，推动个性化医疗发展。此外，它还为药物研发提供靶点，加速新药创制进程。而近年来，全新一代高分辨率Astral质谱的崭露头角，为蛋白质组学研究注入了全新的活力。

图1 蛋白质组学的应用场景（Yang at al., 2021）。

蛋白质组学通过分离、鉴定和定量蛋白质，结合质谱分析、二维凝胶电泳、液相色谱等技术，揭示蛋白质动态变化和调控机制。随着科学技术的飞速发展，蛋白质组学领域涌现出了多种方法，如TMT、Label Free、DIA等，由小医为大家介绍一下这几种蛋白质组学方法：

01 TMT蛋白质组学

TMT（Tandem Mass Tag）是一种基于同位素标记的多重定量蛋白质组学技术，通过化学标签标记不同样本的肽段，结合质谱分析实现多组样本同步定量。其核心依赖三个功能基团，反应基团：含N-羟基琥珀酰亚胺酯（NHS ester），特异性结合肽段氨基（赖氨酸侧链或N端），形成稳定共价连接，确保不同样本标记的准确性；质量平衡基团：通过同位素（如¹³C、¹⁵N）差异设计，使不同标签整体分子量相同，在质谱MS1阶段，同一肽段的不同标记版本合并为单一峰，避免信号分裂，提升检测灵敏度，支持多达18样本同步分析；报告基团：在质谱MS2阶段断裂，释放特定质量的报告离子（如126-131 Da），其强度比例反映原始样本中肽段的丰度差异，实现精准定量。

这种技术的优势在于可以在一次质谱分析中同时对多个样品进行定量分析，具有较高的通量，并且定量结果较为准确，能够为研究人员提供可靠的蛋白质表达水平信息。然而，TMT标记过程较为复杂，对样品的预处理和标记反应要求严格，稍有不慎就可能导致标记不完全或出现标记偏差。此外，它的动态范围相对较窄，在检测高丰度和低丰度蛋白质时存在一定局限。

图2 TMT蛋白质组学实验流程（Yang at al., 2024）。

02 Label Free蛋白质组学

Label Free 技术则是一种不依赖任何同位素标记的方法，直接依据质谱检测到的肽段信号强度来进行蛋白质的定量分析。通过对不同样品中相同肽段的信号强度进行对比，就能得知蛋白质表达水平的相对变化。该技术的优势在于无需对样品进行标记，大大简化了实验流程，降低了实验成本。而且，它对样品的适用性非常广泛，不受样品类型和蛋白质丰度的限制。

不过，由于缺乏标记作为参照，Label Free 技术的定量准确性相对较低，容易受到质谱仪器性能和样品复杂性的影响。同时，它的数据采集模式为Data-Dependent Acquisition（DDA）模式下，质谱仪优先选择信号强度较高的离子进行二级质谱分析，这可能导致低丰度蛋白质的信号被忽略，从而限制了对低丰度蛋白质的检测。这种“先强后弱”的采集方式容易造成低丰度肽段信息的丢失。

图3 Label Free蛋白质组学检测流程（Escobés at al., 2022）。

03 DIA蛋白质组学

DIA技术是一种数据非依赖型的质谱数据采集方式（Data - Independent Acquisition, DIA）。在采集质谱二级谱图时，DIA技术会根据所有离子的质荷比范围划分窗口，依次采集所有肽段离子的二级谱图信息。然后通过对这些二级谱图信息进行分析，实现对蛋白质的定性和定量分析。这种技术的数据采集模式较为全面，能够获取更多的肽段信息，从而提高了蛋白质鉴定的覆盖率和定量准确性。而且，它的随机性较低，能够提供更稳定的定量结果。但DIA技术的数据分析过程相对复杂，需要建立二级谱图库来进行蛋白质鉴定和定量分析。

图4 DIA与DDA数据采集模式的对比（Krasny at al., 2021）。

图5 TMT、Label Free、DIA三种蛋白质组学的对比。

（1）4D – DIA蛋白质组学

4D – DIA蛋白质组学技术是在传统DIA技术的基础上，增加了离子淌度这一维度的信息。在质谱分析过程中引入离子淌度分离，能够更有效地分离和鉴定复杂的肽段混合物，进而提高蛋白质鉴定的准确性和覆盖率。它结合了DIA技术和离子淌度技术的优势，具有更高的检测灵敏度和分辨率，能够处理更复杂的样品，在检测低丰度蛋白质方面具有显著优势。4D-DIA通过离子淌度（第四维度）分离离子，虽然降低了谱图复杂性，但与传统3D-DIA相比，数据维度增加导致解析难度显著提升。同时，由于其TOF检测器和离子淌度分离技术的固有局限，在处理超复杂样本或极低丰度蛋白时可能无法达到Orbitrap Astral平台的分析深度。

（2）Astral-DIA蛋白质组学

Astral-DIA基于质谱技术，其核心是Orbitrap Astral质谱仪的高分辨率和高灵敏度，能够实现窄窗口式数据非依赖性采集（nDIA）。质谱仪将全质量范围的前体离子注入Orbitrap，进行MS1全扫描和MS2扫描，隔离窗口可窄至2Da，提高了离子的选择性和定性定量的准确性。

图6 我司Orbitrap Astral质谱仪

1）高分辨率与高灵敏度

Astral质谱仪采用了极为先进的质量分析器技术，全质量扫描也在Astral分析仪中定期进行自动增益控制（AGC），Orbitrap Astral的分辨率可达24万，扫描速度可至200HZ，DIA的隔离窗口可窄至2Da，并且其在扫描速度较高的情况下，仍然具有较高的分辨率、灵敏度以及更深的覆盖范围。

2）高通量与深覆盖度

Astral质谱仪拥有极高的检测通量，能够在短时间内完成大量样品的分析。Orbitrap Astral高分辨率质谱仪可在8分钟内鉴定8000多个蛋白质，每天检测样本最多可至180个。上样2μg HEK 293T细胞的蛋白消化液平均可以鉴定到有9879个蛋白质和159627个独特肽及164216个修饰肽（Guzman et al., 2024）。

图7 Orbitrap Astral质谱在酵母细胞和HEK 293T细胞的蛋白检测数据（Guzman et al., 2024）。

3）精准的定量分析

Astral质谱仪在定量分析方面表现出色，其定量线性范围可达5个数量级，能够准确检测从高丰度到低丰度的蛋白质。这就好比在一场盛大的蛋白质“聚会”中，无论是那些“明星”高丰度蛋白质，还是那些“默默无闻”的低丰度蛋白质，Astral都能精准地统计出它们的数量，为研究人员提供可靠的定量数据。

伯远医学Astral-DIA蛋白质组学服务基于先进的Orbitrap Astral质谱平台，提供高通量、高灵敏度的蛋白质组学分析。提供从样本前处理、上机检测到实验报告的一站式解决方案，适用于基因功能研究、疾病标志物筛选、药物作用靶点研究等多个领域。

参考文献

1.Escobés I, Azkargorta M, Iloro I, et al. Differential Proteomic Analysis of Complex Mixtures by Label-Free nLC MS/MS[M]//Mammary Stem Cells: Methods and Protocols. New York, NY: Springer US, 2022: 111-121.

2.Krasny L, Huang P H. Data-independent acquisition mass spectrometry (DIA-MS) for proteomic applications in oncology[J]. Molecular omics, 2021, 17(1): 29-42.

3.Guzman U H, Martinez-Val A, Ye Z, et al. Ultra-fast label-free quantification and comprehensive proteome coverage with narrow-window data-independent acquisition[J]. Nature Biotechnology, 2024: 1-12.

4.Yang Y Y, Cao Z, Wang Y. Mass Spectrometry‐Based Proteomics for Assessing Epitranscriptomic Regulations[J]. Mass Spectrometry Reviews, 2024.

4.Yang J, Yan Y, Zhong W. Application of omics technology to combat the COVID‐19 pandemic[J]. MedComm, 2021, 2(3): 381-401.