水凝胶的微观形貌表征：SEM、TEM和STEM等该如何选用？

在水凝胶材料研究中，观察其微观结构是理解其性能的关键。本文聚焦扫描电镜（SEM）、冷冻电镜（Cryo-SEM）、透射电镜（TEM/STEM）及原子力显微镜（AFM）五种技术，系统解析其原理、水凝胶样品制备要点及典型应用场景，助力研究者根据材料特性选择合适设备，优化实验，以准确观察材料形貌。

一、扫描电子显微镜（SEM）：表面三维

形貌的高分辨观测

SEM通过电子枪发射高能电子束（5-30 keV），经电磁透镜聚焦至纳米级光斑，在样品表面进行光栅扫描。电子与样品原子相互作用产生二次电子、背散射电子等信号，通过探测器收集并转化为表面形貌的三维图像，分辨率可达5-10 nm，适合观察微米至纳米尺度的表面特征，如孔隙率、粗糙度及断裂面形貌。

图1 扫描电镜图像

扫描电镜样品制备的关键步骤：

1. 脱水处理

冷冻干燥法：溶胀态样品经-80℃预冻2h或液氮速冻10min后，在冷冻干燥机中升华脱水（避免室温脱水导致的网络塌陷）。需注意离子交联水凝胶（如海藻酸盐）可能因玻璃化转变产生表面皱缩，可改用乙醇梯度脱水（25%→50%→75%→100%乙醇，每级10-15min）减少结构损伤。

临界点干燥法：适用于生物样品或高含水凝胶。首先用2.5%戊二醛固定4h以上，经梯度脱水后，以液态CO₂置换溶剂，在临界条件（31℃, 7.38MPa）下消除气液界面张力，最大程度保留原始孔隙结构。

2. 断面制备

干燥样品后，我们还需要制作出断面，才能观察到样品内部的微观结构。断面应无污染、无皱缩、无明显的人工损伤以及附加结构。薄膜样品首选液氮脆断：将样品置于液氮（如泡沫箱盛放）冷冻数分钟，用尖锐工具在边缘切口后掰断；韧性样品可用锋利刀片快速划开表面，避免剪刀剪切导致断面变形。也可在冷冻干燥前先进行液氮脆断，再冻干处理。

3. 表面导电处理

一般导电性差的样品需喷镀金膜后拍摄，喷金薄膜需要在10万倍率下才能观察到金颗粒，因此样品表面的金属膜对材料的形貌影响忽略不计。盐等非导电材料会导致电子束照射时电荷积累，造成图像失真、模糊或其他伪影，因此在样品制备时尽量避免引入无机盐。

扩展应用

与EDS能谱仪联用，在观察高分辨率的微观形貌的同时，还可针对选定微区进行化学成分分析，实现特定元素的位置重建。但是需要注意，EDS只能对元素含量进行半定量分析。

二、冷冻扫描电镜（Cryo-SEM）：含水

样品的原位观测技术

针对常规SEM干燥过程对水凝胶结构的破坏，Cryo-SEM通过超低温冷冻固定技术，直接观测含水样品的原始形貌。核心优势在于避免脱水导致的网络收缩，尤其适合研究水凝胶溶胀态的孔道结构与界面特征。

图2 冷冻扫描电镜（a,b）和常规扫描电镜（c,d）

冷冻扫描电镜的制样过程分为冷冻固定、冷冻断裂、升华及导电性喷涂四个步骤：

1. 玻璃态冷冻固定

高压冷冻法：在2100 bar高压下，用液氮将样品速冻至玻璃态（≤100 μm厚度），抑制冰晶形成以保留原生结构。

液氮泥冷冻法：在低真空（~0.1 Pa）环境下，利用液氮的过冷态（泥状）快速冷冻薄层样品（<50 μm），减少冰晶损伤。

2. 冷冻断裂与升华蚀刻

在-100℃真空环境下断裂样品，暴露新鲜截面；通过控制升华条件（-90℃, 数分钟至数十分钟）去除表面冰层，显露内部网络结构。需注意过度升华会导致孔壁坍塌，需通过预实验优化蚀刻时间。

3. 低温观测

样品经导电喷涂处理后（一般喷铂），置于设备的-160℃冷台上，在高真空下实现含水结构的原位观测，分辨率可达10-20 nm。

三、透射电子显微镜（TEM）：纳米级

内部结构的二维解析

TEM利用80-300 keV高能电子束穿透超薄样品（100-200 nm），通过样品对电子的散射差异形成衬度图像，分辨率可达0.2 nm，可观测水凝胶的交联网络、纳米颗粒分散性等内部特征。

透射电镜的样品制备分为以下几步：

1. 超薄切片技术

干燥样品经-70℃冷冻后，使用Leica EM FC7冷冻超薄切片机，配合金刚石刀制备100 nm厚度切片，避免室温切片导致的结构形变。

低强度样品需包埋处理：OCT水凝胶包埋剂适用于水溶性体系，环氧树脂包埋可增强机械强度，便于切片操作。

2. 溶液样品处理

微凝胶分散液经超声处理后滴至铜网，自然干燥后可采用负染色技术（如2%磷钨酸）增强衬度，适用于观测纳米级颗粒的形貌与分布。

四、扫描透射电子显微镜（STEM）：

软材料的低损伤成分成像

作为TEM的改进模式，STEM采用低加速电压（50-200 keV），可显著减少电子束对水凝胶的辐照损伤，并大大提高图像衬度，特别适合于水凝胶这类软材料样品的透射分析。通过 STEM 得到的明场（ABF）像与通过普通透射电镜得到的 BF 像类似，可以形成各种衬度的像；高角环形暗场像（HAADF）为非相干高分辨像，图像衬度不会随着样品的厚度及物镜的聚焦的改变而发生明显的变化，像中亮点的强度与原子序数的平方成正比，因此可以反映出原子的化学成分信息。与 X 射线能谱分析（EDS）联用，可以对样品中原子分布进行表征（图4）。

HAADF信号强度与原子序数Z的平方成正比，有些元素原子序数低，可能不好分辨，可以将原子序数较高的元素（如I）标记到高分子链段上，从而方便观察，如图5。

图4 扫描透射电镜图（a为样品的BF图；b为样品的HAADF图；c为EDS图；d是b和c图的叠加图）

图5 水凝胶的BF图（a）；HAADF图（b）；EDS图（c）；b和c图叠加图

STEM成像包含明场像（Annular bright field, ABF）、暗场像（Annular dark field, ADF）和备受关注的高角环形暗场像（High angle annular dark field, HAADF）。由于各种成像模式收集的散射信号接收角度不同，因此在实验过程中可一次获取同一位置的不同图像，反应材料的不同信息，如下图6。

STEM样品制备方法与TEM中制备方法一致。样品厚度一般在100nm左右，尺寸为5μm*5μm。

五、原子力显微镜（AFM）：纳米尺度

力学-形貌耦合表征

AFM属于扫描探针显微技术（SPM），与电镜技术（依赖电子束）本质不同。STEM 需在真空下测试，水凝胶需脱水处理，所得结构非真实状态。而AFM可在溶液、大气、真空环境下工作，适合原位表征水凝胶结构。在AFM的诸多成像模式中，峰值力轻敲成像模式（PeakForce Tapping Mode，PFT）通过扫描管的移动来保持探针和样品之间的峰值力恒定，从而反映出表面形貌。其优点是直接用力做反馈使得探针和样品间的相互作用可以很小，这样就能够对很黏很软的样品成像；同时，使用力直接作为反馈，能对黏软样品成像并定量获取表面力学信息，且制样简单、样品损伤小。

AFM样品制备要点：

样品表面应光滑以避免纳米级起伏导致探测盲区，且需牢固固定于清洁基底（如云母片、硅片等），常用胶固定（导电实验用银胶，液下成像需选耐溶剂胶）或静电吸附（如 DNA 样品固定于带正电云母片）。以光固化水凝胶为例：溶胀平衡后切成 3mm×3mm×2mm 块，滤纸吸干表面溶液，用 460 胶固定于载玻片，盐水冲洗残留胶水后重新浸没平衡 10-20 分钟即可测试。

AFM的测试模式

1. 定量纳米力学分析

定量纳米力学分析（QNM）是峰值力轻敲模式的一个重要应用，在对样品表面形貌进行高分辨率成像的同时还可以对材料进行纳米尺度的力学分析，通过力-位移曲线可以得到杨氏模量、粘附力、能量耗散和最大形变量等信息。如下图7所示。

图7 水凝胶杨氏模量分布和局部放大图

2. 相位模式

由于QNM微观力学测试中分辨率有限，因此可以使用相位图来表征水凝胶的微观结构。相位图是在原子力显微镜的轻敲模式下，通过振动的微悬臂与样品表面接触得到的振动相位的变化（滞后）图像。引起该相移的因素很多，如样品的组分、硬度、粘弹性质，模量等。因此利用相位模式，可以在纳米尺度上获得样品表面局域性质的丰富信息。如图8，其中高相位角的亮区对应模量较高的区域，低相角的暗区对应模量较低的区域。

图8 不同配比水凝胶的AFM相位图像

六、技术选择与应用场景总结

结语

五种技术各有其不可替代的优势：电镜技术（SEM/TEM/STEM）在结构分辨率与成分分析上表现卓越，适合解析水凝胶的精细构造；AFM作为扫描探针技术的代表，在原位力学表征与软材料兼容性上独具优势。实际应用中，需根据研究目标（如表面/内部结构、干燥/湿润状态、形貌/力学耦合）选择单一或联合表征手段，结合样品特性优化制备流程，方能实现对水凝胶微观形貌的准确解析。