Aislamiento de Microorganismos { Diversidad Metabolica

Trabajo Práctico Nº4

Aislamiento de Microorganismos

Diversidad Metabólica

Objetivo del Trabajo Práctico

Aislamiento de microorganismos partir de
distintos inóculos (agua, ricota, arroz, tierra
y yogurt)

1)Enriquecimiento-Selección
2)Selección-Diferenciación
3)Obtención de un cultivo puro (Tinción de
Gram y Pruebas Bioquímicas)

Microorganismos a aislar:

• Enterobacterias (agua)
• Pseudomonas spp. (agua)
• Staphylococcus spp. (ricota)
• Bacillus spp. (arroz)
• Lactobacillus spp. (yogurt)
• Azotobacter spp. (tierra)

Medios de Cultivo: características generales

•Disponibilidad de nutrientes (C, N, sales inorgánicas,
vitaminas)

•Disponibilidad de oxígeno

•pH

•Humedad

•Temperatura

•Esterilidad

• Medios Definidos o Complejos

• Medios Mínimos (definidos) o Ricos
(complejos).

•Medio Definido: los componentes del medio (y sus concentraciones)
son conocidos.

Ejemplo de Medio Definido para Escherichia coli:
Componente Gramos/litro
Glucosa 5 Fuente de C y
energía
Na2HPO4 6 Buffer, fuente de P

KH2PO4 3 Buffer, fuente de P

NH4Cl 1 Fuente de N

NaCl 0.5 Fuente de Na

MgSO4•7H2O 0.12 Fuente de Mg

CaCl2•2H2O 0.01 Fuente de Ca

•Medio Complejo: se agregan ingredientes cuya composición exacta de
desconoce (extractos, peptonas, etc).

Ejemplo de Medio Complejo para Salmonella:
Extracto de 5 Fuente de aminoácidos, nucleótidos, vitaminas y
carne micronutrientes. También fuente de C.
Peptona 6 Fuente de aminoácidos, nucleótidos, vitaminas y
micronutrientes. También fuente de C.
Glucosa 5 Fuente de C y energía.

Na2HPO4•12H2O 4 Buffer y fuente de P.
FeSO4•7H2O 0.3 Indicador de producción de H2S. Fuente de Fe
y S.
Indicador 8 Inhibe el crecimiento de Gram positivos
Sulfito de
Bismuto
Verde Brillante 0.025 Inhibe el crecimiento de Gram positivos

Ágar 20

Peptonas: péptidos (aminoácidos libres), carbono y nucleótidos.

•Peptona de caseína (triptona): degradación pancreática de la
caseína.

•Peptona de carne: degradación pancreática de la carne.

•Peptona de gelatina: degradación pancreática de la gelatina.

•Proteosa peptona: peptona de mayor calidad, con alta proporción
de péptidos de menor PM, aminoácidos libres y factores de
crecimiento.

•Extracto de levadura: es la parte hidrosoluble de la levadura
autolizada. Alto contenido de vitaminas.

•Medio Mínimo: posee la mínima cantidad de nutrientes requeridos
para el crecimiento. Es un medio definido. Por ej.: M9.

•Medio Rico: posee gran variedad de nutrientes y en abundancia
(provenientes de extractos y peptonas). Por lo general son medios
complejos.

Por ej: Luria-Bertani (LB):


Triptona 10 Aminoácidos, carbono, energía, macro y
micronutrientes.
Extracto de 5 Vitaminas, macro y micronutrientes.
Levadura
NaCl 10 Balance osmótico.

•Medio de Enriquecimiento: se utiliza como primer paso en el
aislamiento de bacterias. Contiene sustancias que permiten enriquecer el
cultivo en el organismo de interés.

•Medio Selectivo: posee sustancias que permiten el crecimiento de un
grupo de bacterias y que inhiben el desarrollo de otros grupos. Por ej:
sales biliares y cristal violeta: inhiben el crecimiento de Gram
positivos.

•Medio Diferencial: contiene compuestos que permiten detectar algún
cambio de color en el medio cuando ocurre una determinada reacción
química. Por ej: azul de bromocresol: indicador que vira al amarillo
cuando el pH del medio es ácido (permite distinguir a las bacterias
que fermentan lactosa).

•Medio Selectivo y Diferencial.

Pasos a seguir para aislar un microorganismo (y caracterizarlo):

1. Inocular la muestra (agua, tierra, yogurt, ricota o arroz) en
un caldo de enriquecimiento.

2. Incubar a la temperatura y tiempo adecuados.

3. Estriar en medio selectivo (además puede ser diferencial).
Obtención de colonias aisladas.

4. Tinción de Gram

5. Pruebas Bioquímicas: TP Nro. 5.

Enterobacterias
 γ-Proteobacteria
 Bacilos Gram negativos
 Fermentadores de glucosa
 Anaerobios facultativos
 Flagelos peritricos
 Escherichia coli (algunas cepas patógenas)
 Salmonella, Shigella, Enterobacter, Yersinia, Klebsiella,
Proteus, entre otros. Todos con especies patógenas.
 Oxidasa negativos

Aislamiento de Enterobacterias (agua)

1. Sembrar en Caldo Mac Conkey (2x): medio de enriquecimiento y
selectivo para el aislamiento de enterobacterias de agua y leche.

Peptona de Caseína
Lactosa
Bilis de Buey
Púrpura de Bromocresol
pH= 7,4±0,2

Incubar por 48 hs a 37ºC

Si hay fermentación de lactosa:

Sólo ácido Coliformes, sin E. coli
Gas + ácido E.coli (junto a otras coliformes)


Crecimiento en Cambio de Formación de
Caldo Mac Conkey color a Gas
amarillo
Escherichia coli Bueno Sí Sí
(lactosa +)
Enterobacter Bueno Sí Sí
cloacae
(lactosa +)
Klebsiella pneumoniae Bueno Sí Sí
(lactosa +)

Proteus mirabilis Bueno No No

Pseudomonas Malo
aeruginosa
Staphylococcus Malo
aureus

Si hay formación de gas y el pH del medio se acidifica, entonces, el
siguiente paso es estriar en ágar Mac Conkey y ágar EMB.


2. Ágar Mac Conkey: medio selectivo y diferencial.

•Peptona de Caseína
•Peptona de Carne Apariencia de las Microorganismo
•Cloruro de Sodio colonias
•Lactosa Grandes, rojas, con Escherichia coli (lactosa +)
•Sales biliares halo
•Cristal violeta Grandes, rosadas, Enterobacter spp., Klebsiella
•Rojo Neutro mucoides spp. (lactosa +)
pH= 7,1±0,1 Incoloras, Salmonella spp., Shigella spp.,
Incubar por 24 hs transparentes Proteus spp.
a 37ºC Pequeñas, opacas, Enterococci, Staphylococci
aisladas

Ágar Mac Conkey

Lactosa + Lactosa -

Escherichia coli Salmonella typhimurium

2. Ágar EMB: medio selectivo y diferencial
(enterobacterias patógenas).

•Peptona de Carne
•Hidrógenofosfato dipotásico
•Lactosa
•Sacarosa Apariencia de las Microorganismo
colonias
•Eosina Amarillenta
Transparentes, de color Salmonella spp., Shigella spp.
•Azul de Metileno
ámbar
pH=7,0±0,2
Verdosas con brillo Escherichia coli (lactosa +,
metálico a la luz sacarosa +)
Incubar por 24 hs reflejada, con el centro
a 37ºC negroazulado a la luz
transmitida
Más grandes que las de Enterobacter spp., Klebsiella
E. coli, mucosas, spp. (lactosa+, sacarosa-)
confluentes, con el
centro pardo-grisáceo a
la luz transmitida

Ágar EMB

Lactosa + Lactosa +

Escherichia coli Enterobacter spp.

Pseudomonas spp.
 γ-Proteobacteria
 Bacilos Gram negativos
 Aerobios estrictos
 Con flagelos polares
 Producen pigmentos
 No fermentadores
 Oxidasa positivos
 Patógenos de plantas/infecciones oportunistas en humanos

Aislamiento de Pseudomonas aeruginosa (agua)

1. Sembar en Caldo M9 (2x) e incubar por 48 hs a 42ºC:
enriquecimiento y selección.

2. Estriar en Ágar Cetrimida: medio selectivo para Pseudomonas
aeruginosa

• Peptona de Gelatina
• MgCl2
• Cetrimida
• Glicerina
• SO4K2

Incubar por 48 hs a 37ºC.
Pseudomonas aeruginosa

Staphylococcus spp.
• Cocos Gram positivos
• Anaerobios facultativos
• Fermentan glucosa (ac. láctico)
• Asociados a piel y mucosas
• Patógenos (S. aureus)
• Resisten altas concentraciones salinas

Aislamiento de Staphylococcus aureus (ricota)

1. Ricota en Agua Peptonada: enriquecimiento (2 hs a temperatura
ambiente)

2. Mezclar con Caldo Cerebro Corazón (con NaCl 13%): medio selectivo
para Estafilococos patógenos.

• Infusión de cerebro
• Infusión de corazón
• Proteosa peptona
• D(+) Glucosa
• NaCl (7.5% final)
• Hidrógenofosfato disódico
pH=7,4±0,2


Si hay crecimiento, estriar en Ágar manitol salado-rojo fenol y Ágar azida

Aislamiento de Staphylococcus aureus
3. Ágar manitol salado-rojo fenol: medio selectivo y diferencial (permite
distinguir entre S. aureus y otras especies no patógenas).

• Peptona de carne Apariencia de las colonias Microorganismo
• Extracto de carne
Con halo amarillo, Manitol-positivos: S.
• NaCl 7.5%
luminoso; crecimiento aureus
• D(-)Manitol
• Rojo fenol intenso
pH=7,4±0,2 Sin cambio de color; poco Manitol-negativos: S.
crecimiento epidermidis y otros.

1. S. aureus
2. S. epidermidis
3. Micrococcus luteus

3. Ágar azida: medio selectivo para Staphylococcus spp.

Bacillus spp.
• Bacilos Gram positivos
• Forman endosporas
• Generalmente móviles con flagelos peritricos
• Aerobios (facultativos)
• B. cereus (alimentos)
• B. anthracis

Aislamiento de Bacillus cereus y Bacillus subtilis (arroz)

1. Arroz en PBS (80ºC por 5 min.): selección.
2. Pasar el sobrenadante a caldo nutritivo: enriquecimiento.
3. Incubar por 48 hs a 37ºC.
4. Estriar en Ágar Mossel con emulsión de yema de huevo: selectivo y
diferencial (permite distinguir entre Bacillus cereus y B. subtilis)

• Peptona de carne
• Extracto de carne
• D(-)Manitol
• NaCl
• Rojo Fenol
• Emulsión de yema de huevo/Polimixina B

Incubar por 48 hs a37ºC.

Bacillus cereus: colonias rugosas, secas, de color rosado y rodeadas de precipitado
blanco (Manitol – y lecitinasa +).

Bacillus subtilis: colonias amarillas y sin precipitado (Manitol + y lecitinasa -).

Lactobacillus spp.
• Bacilos o cocobacilos Gram positivos
• Fermentadores lácticos
• Aerobios facultativos o microaerófilos

Aislamiento de Lactobacillus spp. (yogurt)

1. Ágar De Man, Rogosa y Sharpe (MRS): medio de enriquecimiento
selectivo.
Polisorbato, acetato, magnesio y manganeso.
pH = 5.7.
Incubación en microaerobiosis.

2. Ágar Rogosa: medio más selectivo que el
anterior, con mayores concentraciones de
acetato y pH = 5.5 que inhiben flora
acompañante.
Incubación en microaerobiosis.
Ágar MRS-Lactobacillus casei

Azotobacter spp.
• Bacilos o cocos Gram negativos
• Habitan en el suelo y en el agua
• Fijan nitrógeno atmosférico (N2 a NH3)
• Vida libre
• Forman quistes (similar a endosporas)

Medio Fred & Waksman: medio selectivo sin fuente de
nitrógeno. Contiene manitol (azúcar fermentable).
Crecimiento a 28ºC.

Microorganismo Enriquecimiento Selección-
-Selección Diferenciación
Agua Enterobacterias Caldo Mc Ágar Mc Conkey
Conkey y ágar EMB
Agua Pseudomonas Caldo M9-42ºC Ágar Cetrimida
Ricota Staphylococcus Caldo cerebro- Ágar manitol
corazón con salado rojo
7.5% NaCl fenol y ágar
azida
Arroz Bacillus 80ºC y caldo Ágar Mossel con
nutritivo emulsión de
yema de huevo y
PmB.
Yogurt Lactobacillus Ágar MRS Ágar Rogosa
Microaerobiosis Microaerobiosis
Tierra Azotobacter Caldo Fred& Ágar Fred &
Waskman-28ºC Waskman-28ºC

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