Espectroscopia ultravioleta visible 2.pptx

Instituto Tecnológico Nacional de México
Campus Villahermosa
Análisis Instrumental
Mtra.: María Antonieta Toro Falcón
Integrantes:
• Stephanie Chanona Flores
• Carolina Ramos González
• Manuel Alejandro León Cardoza
• Felipe de Jesús Juárez Hernández
• Josué Daniel Camacho Reyes
• Michelle Morales Núñez

ESPECTROSCOPIA VISIBLE:
La espectroscopia visible es una de las técnicas más ampliamente y más frecuentemente empleadas en el análisis
químico. Para que una substancia sea activa en el visible debe ser colorida: el que una substancia tenga color, es
debido a que absorbe ciertas frecuencias o longitudes de onda del espectro visible y transmite otras más. Por
ejemplo: una solución es amarilla debido a que dentro de la región visible absorbe radiación en el rango de 435 a
480 nm. En este rango de longitud de onda se encuentra el color azul del visible, por lo que este compuesto
absorbe el color azul y transmite los colores complementarios que dan origen al color amarillo de la solución
mencionada. La absorción y transmisión de las longitudes de onda de la región visible de esta parte del espectro no
es la misma en substancias que den diferentes tonalidades de amarillo, por lo que podemos tener una gama
diferente de tonalidades como: amarillo canario, amarillo limón, amarillo pálido, etc.

La tabla I nos da una relación entre rango de longitudes de onda en que absorbe el compuesto, color absorbido y
color observado o transmitido. El Ultravioleta del vacío se considera aquella región comprendida de los 100 a los 190
nm. Se le llama así debido a que el nitrógeno atmosférico absorbe este tipo de radiación, por lo que se debe efectuar el
vacío para poder excluir las absorbancias de este gas de las absorbancias del compuesto en estudio. Las
complicaciones técnicas asociadas al vacío necesario, además de la poca utilidad que se tiene en el Ultravioleta del
vacío, han hecho que este técnica prácticamente no tenga uso y de hecho no hay equipos disponibles comercialmente
para aplicaciones de este tipo de espectroscopia. El espectro Visible y Ultravioleta, por el contrario, tienen amplia
aplicación y son técnicas que se emplean continuamente. El rango visible se considera de los 380 a los 750 nm. El
rango del Ultravioleta cercano o del Cuarzo es de 190 a 380 nm. La base de la espectroscopia Visible y Ultravioleta
consiste en medir la intensidad del color (o de la radiación absorbida en UV) a una longitud de onda específica
comparándola con otras soluciones de concentración conocida (soluciones estándar) que contengan la misma especie
absorbente. Para tener esta relación se emplea la Ley de Beer, que establece que para una misma especie absorbente en
una celda de espesor constante, la absorbancia es directamente proporcional a la concentración. La coloración de la
solución se debe a la especie absorbente y esta coloración puede ser natural o inducida. La coloración natural puede
ser la base de la cuantificación de una especie, como por ejemplo: la clorofila en ciertas plantas, los complejos
metálicos que se encuentran presentes en solución acuosa, como son los iones de Cobre (II), Manganeso (VII),
Cobalto (III), etc.

Más frecuentemente, se induce a la formación de un complejo colorido que absorba en el visible, y que sea específico para el
elemento o compuesto que se desea cuantificar colorimétricamente. Ejemplo: la formación de un complejo colorido cuando el
cloro libre reacciona con la ortotoluidina, o la cuantificación de glucosa en la sangre y orina por la acción del molibdato en
determinadas condiciones, o la intensificación del color del ion cobre, al formar un complejo amoniaco-cobre, el cual se forma
cuando a una solución acuosa que contiene iones cobre se le agrega hidróxido de amonio.
Para esto se requiere de un control de ciertas condiciones, que inhiben o favorecen la formación de compuestos coloridos:
pH: El pH es un factor determinante en la formación de ciertos complejos o compuestos coloridos. Cuando el pH influye en la
técnica analítica, se requiere de un control adecuado de este valor para lo cual se agrega alguna solución buffer, o estabilizador de
pH.
Temperatura: La temperatura es factor importante, sobre todo en reacciones en las cuales el factor cinético es la base del análisis.
Tiempo: En ciertas reacciones, se requiere de un tiempo determinado para que se tenga una lectura estable de absorbancia de la
solución producida.

Las técnicas analíticas UV-Visible han recibido gran aceptación debido, entre otras a las siguientes razones: 1. Amplio
campo de aplicación: Como ya se ha mencionado, las técnicas espectroscópicas UV-Vis., son ampliamente empleadas
ya que son muchas las especies que son activas en el Visible, y muchas más las que con un tratamiento adecuado son
capaces de formar especies coloridas. Lo mismo puede decirse de la espectrocopia UV. 2. Selectividad adecuada:
Aunque no es muy común si es posible tener interferencias en UV-Visible. Cuando esto ocurre, es posible emplear los
métodos para análisis de multicomponentes. Otra alternativa es aislar el analito de la interferencia, o separa la
interferencia misma. 3. Buena Exactitud y Precisión: En estas técnicas espectroscópicas es normal tener errores
relativos del 1 al 3 %, por lo cual se puede considerar que se tendrán resultados analíticos con un mínimo de
incertidumbre si se procede en la forma correcta. 4. Facilidad y Conveniencia: Aunque existen instrumentos
altamente sofisticados acoplados a computadoras y con sistemas ópticos y electrónicos de alta precisión, es posible
obtener resultados muy aceptables para análisis de rutina, con instrumentos o espectrofotómetros de los más
sencillos en el mercado, a un costo muy accesible.

ESPECTROSCOPIA ULTRAVIOLETA
El espectro Ultravioleta y Visible de las moléculas está asociado a transiciones electrónicas entre los diferentes niveles
energéticos en ciertos grupos o átomos de la molécula y no caracterizan a la molécula como entidad. En contraste la
absorción de energía en la región Infrarroja estimulan la molécula completa y causa cambios vibracionales y
rotacionales en esta lo cual caracteriza la entidad estructural de dicha molécula. Los grupos de átomos que dan origen
a la absorción en el UV cercano o UV de cuarzo, se conocen como grupos cromóforos. La mayoría de los grupos
insaturados y heteroatómicos que tienen pares de electrones no compartidos, son cromóforos potenciales y estos
grupos son la base de la elucidación de grupos estructurales en las moléculas activas en el UV cercano. TEORIA DE
ORBITALES MOLECULARES.- Cuando dos átomos forman un enlace químico, los orbitales atómicos de cada uno
de ellos se combinan para formar dos orbitales moleculares, uno de baja energía que es el orbital enlazante y otro de
energía mayor, que es el orbital antienlazante (Figura 1). Los enlaces covalentes que se originan entre los orbitales de
dos átomos que se enlazan químicamente pueden ser de dos tipos y se conocen como enlaces σ y enlaces π

Al efectuarse dicho enlace covalente se forman simultáneamente orbitales antienlazantes: σ* en el caso de un orbital
molecular enlazante σ y π* en el caso de un orbital molecular enlazante π. Los electrones que no participan en la
formación de enlaces covalentes en la molécula, se denominan electrones n o no enlazantes. En las moléculas
orgánicas los electrones n están localizados principalmente en los orbitales atómicos de átomos como: Nitrógeno,
Oxígeno, Azufre y del grupo de los halógenos. El diagrama de energía para los orbitales moleculares enlazante,
antienlazante y no enlazante así como las transiciones electrónicas posibles es el mostrado en la Figura 2.
La absorción de energía radiante en el Ultravioleta o Visible por los electrones n, σ ó π resulta en la excitación de éstos,
los cuales pasan a ocupar alguno de los orbitales antienlazantes. La absorción de radiación Ultravioleta o Visible es
capaz de efectuar dichas transiciones.

En la Figura 2 se representan las transiciones posibles en una molécula. De acuerdo a este diagrama el orden energético
en estas transiciones el de mayor energía es σ→σ∗ y el de menor energía n →π∗ Mientras mayor sea la energía requerida
para una determinada transición, menor es la longitud de onda de la radiación que debe suministrarse para conseguir tal
fin; por ejemplo: la transición σ→σ∗ para el propano requiere de radiación de 135 nm, la cual se encuentra en la región
del Ultravioleta lejano por lo que es necesario un equipo de alto vacío si se desea estudiar dicha región del espectro. La
transición n →π∗ es la que requiere de menor energía y mayor longitud de onda. Las cetonas y aldehídos saturados
efectúan esta transición a una longitud de onda de aproximadamente 285 nm. Es necesario hacer notar que asociado a
estas transiciones electrónicas existen cambios rotacionales y vibracionales en la molécula lo cual origina que el espectro
obtenido se aun espectro de bandas y no un espectro de una o más líneas agudas, como sí ocurre en un átomo.

ESPECTROSCOPIA ULTRAVIOLETA VISIBLE
La espectroscopia ultravioleta-visible o espectrofotometría ultravioleta-visible (UV/VIS) es
una espectroscopia de fotones y una espectrofotometría. Utiliza radiación electromagnética (luz) de las regiones visible,
ultravioleta cercana (UV) e infrarroja cercana (NIR) del espectro electromagnético. La radiación absorbida por las
moléculas desde esta región del espectro provoca transiciones electrónicas que pueden ser cuantificadas.
La espectroscopia UV-visible se utiliza para identificar algunos grupos funcionales de moléculas, y además, para
determinar el contenido y fuerza de una sustancia.
Se utiliza de manera general en la determinación cuantitativa de los componentes de soluciones de iones de metales de
transición y compuestos orgánicos altamente conjugados.
Se utiliza extensivamente en laboratorios de química y bioquímica para determinar pequeñas cantidades de cierta
sustancia, como las trazas de metales en aleaciones o la concentración de cierto medicamento que puede llegar a ciertas
partes del cuerpo.

Una diferencia obvia entre ciertos compuestos es su color. Así, la quinona es amarilla; la clorofila es verde; los 2.4
derivados del dinitrophenylhydrazone de aldehídos y de cetonas se extienden en color de amarillo brillante a de color
rojo oscuro, dependiendo de la conjugación del enlace doble; y el aspirin es descolorido.
Longitud de onda: se define como la distancia entre los picos adyacentes y puede ser medida en metros, centímetros,
o nanómetros (10-9 meters).
Frecuencia: es el numero de ondas por ciclos usualmente sus unidades están dadas en Hertz que son ciclos por
segundos (Hz).
La luminiscencia ocurre debido a la emisión de luz por una sustancia determinada y esto ocurre cuando un electrón
regresa a su estado inicial después de haber sido excitado y libera una energía como un fotón. Podemos encontrar tres
tipos de nombres para la espectroscopia de luminiscencia, para diferentes técnicas:
Espectroscopia de fluorescencia molecular
Espectroscopia de fosforescencia molecular
Espectroscopia de quimioluminiscencia

El principio de la espectroscopia ultravioleta-visible involucra la absorción de radiación ultravioleta – visible por una
molécula, causando la promoción de un electrón de un estado basal a un estado excitado, liberándose el exceso de
energía en forma de calor. La longitud de onda (λ) comprende entre 190 y 800 nm.
La luz visible o UV es absorbida por los electrones de valencia, éstos son promovidos a estados excitados (de energía
mayor). Al absorber radiación electromagnética de una frecuencia correcta, ocurre una transición desde uno de estos
orbitales a un orbital vacío. Las diferencias entre energías varían entre los diversos orbitales. Algunos enlaces, como los
dobles, provocan coloración en las moléculas ya que absorben energía en el visible así como en el UV, como es el caso
del β-caroteno.
Cuando un haz de radiación UV-Vis atraviesa una disolución conteniendo un analito absorbente, la intensidad incidente
del haz (Io) es atenuada hasta I. Esta fracción de radiación que no ha logrado traspasar la muestra es denominada
transmitancia (T) (T = I/Io). Por aspectos prácticos, se utizará la absorbancia (A) en lugar de la transmitancia (A = -
logT), por estar relacionada linealmente con la concentración de la especie absorbente según la Ley de Beer-Lambert:
A = ε·l·c (ε: coeficiente de absortividad molar, l: camino óptico, c: concentración de la especie absorbente).

Espectrofotómetro ultravioleta visible
Un espectrofotómetro es un equipo utilizado para medir la absorbancia de una muestra, en función de la longitud de
onda de una radiación electromagnética. Hay varios tipos de espectrofotómetros. Éstos se agrupan de acuerdo al tipo
de muestra analizada; los hay de absorción atómica y de absorción molecular (que comúnmente se conoce como
espectrofotómetro UV-VIS).
Componentes:
FUENTE DE LUZ
Este es uno de los componentes espectrofotómetro pues se encarga de iluminar la muestra química o biológica a
analizar. Debe cumplir diferentes condiciones si quieres un buen funcionamiento; por ejemplo: estabilidad,
direccionalidad, distribución de energía espectral continua y contar con una larga vida.
Un espectrofotómetro puede contar con diferentes fuentes de luz: lámpara de wolframio o tungsteno, lámpara de arco
de xenón y lámpara de deuterio las cuales se utilizan, sobre todo, en laboratorios atómicos.
MANOCROMADOR
Ahora bien, si vamos a hablar de espectrofotómetro componentes no podemos dejar de lado al monocromador, que es
el encargado de aislar las radiaciones de longitud de onda deseadas, por lo cual obtendrás luz monocromática. Este
cuenta con rendijas de entrada y salida, colimadores y el elemento de dispersión.

COLIMADOR
El lente que lleva el haz de luz entrante con cierta longitud de onda hacia un prisma, el cual se encarga de separar todas
las longitudes de onda y que lo redireccionará, de esta manera, hacia la rendija de salida.
COMPARTIMIENTO DE MUESTRA
Como su nombre lo indica es donde se coloca la muestra y se lleva a cabo la interacción R.E.M. con la materia.
DETECTOR
El detector es uno de los componentes de espectrofotómetro encargados de evidenciar una radiación para ser
estudiada posteriormente y saber a qué tipo de respuesta se enfrentará, ya sea fotones o calor.
REGISTRADOR
Se encarga de convertir el fenómeno físico en número proporcionales al analito en cuestión.
FOTODETECTORES
Son los que perciben la señal en forma simultánea en 16 longitudes de onda y cubren todo el espectro visible, lo cual
ayuda a reducir el tiempo de medida y minimiza las partes móviles que componen el equipo.

Como funciona:
Un espectrofotómetro UV-VIS se basa en el proceso de absorción de la radiación ultravioleta-visible (radiación con
longitud de onda comprendida entre los 200 y 780 nm) por una molécula. La absorción de esta radiación causa la
promoción de un electrón a un estado excitado. Los electrones que se excitan al absorber radiación de esta frecuencia
son los electrones de enlace de las moléculas, por lo que los picos de absorción se pueden correlacionar con los
distintos tipos de enlace presentes en el compuesto. Debido a ello, la espectroscopía UV-VIS se utiliza para la
identificación de los grupos funcionales presentes en una molécula. Las bandas que aparecen en un espectro UV-VIS
son anchas debido a la superposición de transiciones vibracionales y electrónicas.
La luz tiene una cierta cantidad de energía que es inversamente proporcional a su longitud de onda. Por lo tanto, las
longitudes de onda más cortas de la luz transportan más energía y las longitudes de onda más largas transportan menos
energía. Se necesita una cantidad específica de energía para promover los electrones en una sustancia a una energía más
altaestado que podemos detectar como absorción. Los electrones en diferentes entornos de enlace en una sustancia
requieren una cantidad específica diferente de energía para promover los electrones a un estado de energía más alto. Es
por eso que la absorción de luz ocurre para diferentes longitudes de onda en diferentes sustancias.

Instrumentos usados para titulaciones fotométricas
La fotometría, como técnica instrumental, es un método óptico de análisis químico que está relacionado con la
colorimetría y la espectrofotometría.
La colorimetría se emplea para determinar visualmente la concentración de compuestos coloreados en una solución,
mientras que la fotometría y la espectrofotometría se basan en la medida de la absorbancia de una solución a una
longitud de onda específica empleando fuentes de luz como radiación electromagnética.
Los métodos ópticos se clasifica en:
Métodos espectroscópicos, si existe un intercambio de energía entre la radiación electromagnética y la materia. En
estos métodos se miden el espectro, siendo este debido a transiciones entre distintos niveles energéticos.
Métodos no espectroscópicos, cuando no tiene lugar intercambio de energía como consecuencia de la interacción
materia-radiacción electromagnética. No se producen transiciones entre los diferentes estados energéticos, sino lo que
realmente ocurre son cambios en la dirección o en las propiedades físicas de la radiación electromagnética

Se define la fotometría como técnica óptica de la absorción de radiación que va a permitir relacionar la cantidad de luz
absorbida con la concentración del analito que interesa conocer. La radiación electromagnética es una onda que se
caracteriza por su longitud de onda, frecuencia ν amplitud y abarca desde 390 nm a 750 nm, esto quiere decir que será
la zona visible del espectro.
La radiación u onda electromagnética que puede percibir el ojo humano se define como LUZ VISIBLE y tiene unas
propiedades muy bien definidas:
Se propaga en el vacío a la velocidad de 3x108 m/s.
Se propaga en línea recta.
Se refleja cuando llega a una superficie reflectante.
Se refracta, cuando pasa de un medio a otro.
En general, las sustancias transmiten, absorben y reflejan la luz.

De todas las características de la luz, la absorbancia es la que interesa en las medidas fotométricas. Una sustancia que
se desee medir su concentración y que tiene un color particular absorberá su color complementario y reflejará su
mismo color. Los colores complementarios son opuestos en la rueda cromática.
Por ejemplo, un objeto rojo absorbe luz verde y refleja luz roja.
La absorbancia está relacionada con la concentración de la sustancia que se quiere medir por la ley de Lambert-
Beer. A = ε l c , donde c es la concentración, l es el paso óptico y α es la absortividad molar. Ley de Lambert-Beer
establece que hay una relación lineal entre la absorción de luz a través de una sustancia y la concentración de dicha
sustancia.

Para poder aplicar la ley es necesario seleccionar previamente una longitud de onda puesto que tanto A como α varían
con ella.
Se puede concluir que la cantidad de luz absorbida dependerá del tipo de sustancia por la que atraviesa la radiación, la
distancia que recorre y la concentración de la sustancia.
El Fotómetro y el espectrofotómetro permiten medir la cantidad de luz absorbida y relacionarlo con la concentración
de la sustancia.

Partes esenciales de un fotómetro:
Fuente de radiación
Las características fundamentales de las fuentes
de radiación son la intensidad luminosa, la
estabilidad y además debe ser continua y
constante.
Los fotómetros emplean LED o lámparas de tungsteno wolframio. Las LED emiten una longitud de onda
correspondiente a un parámetro específico. Pueden trabajar sin filtro. Las lámparas de tungsteno wolframio
produce luz "blanca" (incluye todos los colores de luz) y requiere un filtro para obtener una longitud de onda
específica.
Las fuentes de luz LED ofrecen un rendimiento superior en comparación con las lámparas de tungsteno. Los
LED tienen una eficiencia luminosa mucho mayor, proporcionando más luz mientras se usa menos energía.
También producen poco calor, lo que de otro modo podría afectar la estabilidad electrónica. Las lámparas de
tungsteno tiene menor sensibilidad en la alta frecuencia luz azul / violeta.

Filtros de interferencia
Un filtro debe aíslar la radiación de ciertas longitudes de onda. Los filtros ideales deben de aportar alta transmitancia a la longitud de
onda deseada y baja transmitancia a otras longitudes de onda.
Los filtros pueden ser de absorción o interferencia, en el caso de fotómetros y monocromadores de prisma o red, en caso de
espectrofotómetros.
Los nuevos fotómetros emplean filtros ópticos de interferencia que son de banda estrecha de 8 nm y tienen una precisión de ± 1 nm,
con ello se consigue un aumento del 25% en la eficienciade la luz. Estos filtros ópticos mejorados garantizan una buena precisión de la
longitud de onda y permiten recibir una señal más brillante y más fuerte.
Cubeta de medida y portacubetas
Las cubetas deben de tener una absorción mínima a la longitud de onda de trabajo. Se fabrican en material de borosilicato. Lo más
importante en el sistema óptico es que el porta cubetas esté perfectamente sellado contra el polvo, la suciedad, el agua exterior y evite
que penetre la luz exterior.
En el caso de los nuevos fotómetros Hanna, el medidor utiliza un sistema exclusivo de fijación para asegurar que siempre se coloquen
las cubetas en el soporte en la misma posición.
El alojamiento de la zona de paso del haz de luz de la cubeta presenta aristas para proteger del rayado.

Lente de enfoque
La lente de enfoque recoge toda la luz que sale de la cubeta, enfocando en el detector. Con ello se consigue un mayor
rendimiento de luz y una reducción de los errores de medida provocados por las imperfecciones y arañazos que pueda
presentar el cristal.
Sitema de referencia. Detector de referencia.
El sistema de referencia se colocan en los fotómetros de doble haz. Es un sistema de referencia interna (detector de
referencia) del fotómetro para compensar cualquier desviación debida a fluctuaciones de la alimentación o cambios de
la temperatura ambiente.
Fotodetector
Convierte la respuesta del instrumento en una señal medible. En fotometría se utiliza la fotocélula de silicio como
detector. Las características que debe tener un fotodetector pasan por dar una respuesta rápida, generar una
amplificación de la señal y tener una respuesta lineal

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Ley de Beer-Lambert
Se puede decir que esta ley se trata de un medio o método matemático, el cual es utilizado para expresar de que
modo la materia absorbe la luz. En óptica (Rama de la física que se encarga del estudio de la luz) La ley de Beer
afirma que la totalidad de luz que emana de una muestra puede disminuir debido a tres fenómenos de la física,
que serían los siguientes:
1. El número de materiales de absorción en su trayectoria, lo cual se denomina concentración.
2. Las distancias que la luz debe atravesar a través de las muestra. Denominamos a este fenómeno, distancia del
trayecto óptico.
3. Las probabilidades que hay de que el fotón de esa amplitud particular de onda pueda absorberse por el material.
Esto es la absorbencia o también coeficiente de extinción.

A medida que la luz atraviesa un medio que la absorbe, la cantidad de luz absorbida en cualquier volumen
corresponde a la intensidad de luz que incide, luego se multiplica por el coeficiente de la absorción.
Frecuentemente la intensidad de un haz de luz incidente declina significativamente a medida que pasa a
través del medio absorbente. Cuando esta relación se expresa como Ley de Beer Lambert, tenemos que:
T= 10⁻Ꜫcd o T= 10̄ ˉᴬ
Donde,
T = Transmitancia
ε = Coeficiente molar de extinción
c = Concentración molar del absorbente
d = Recorrido en cm

La transmitancia se puede expresar como la intensidad de la radiación incidente, Io. Esto puede dividir a la luz
que emerge de la muestra, I. Se refiere a la relación I/Io como transmitancia o como T. La transmitancia se puede
trazar con relación a la concentración, pero esta relación no sería Lineal. Aunque el logaritmo negativo en base 10
de la transmitancia sí es lineal con la concentración.
A continuación podemos observar un diagrama de la absorción de un haz que atraviesa un recipiente de tamaño l

En términos generales, se mencionan a continuación algunas de las aplicaciones más importantes
de esta ley:
-Si una especie química presenta color, es candidato ejemplar para ser analizada por técnicas
colorimétricas. Estas se fundamentan en la ley de Beer-Lambert, y permite determinar la
concentración de los analitos en función de las absorbancias obtenidas con un
espectrofotómetro.
-Permite construir las curvas de calibración, con las cuales tomando en cuenta el efecto matriz de
la muestra, se determina la concentración de la especie de interés.
-Se usa ampliamente para analizar proteínas, ya que varios aminoácidos presentan absorciones
importantes en la región ultravioleta del espectro electromagnético.
-Las reacciones químicas o fenómenos moleculares que impliquen un cambio en la coloración,
pueden analizarse mediante los valores de absorbancias, a una o más longitudes de onda.
Aplicaciones de la ley de Beer-Lambert

APLICACIÓN DE LA LEY DE BEER LAMBERT PARA EL ANALISIS CUANTITATIVO Y
CUALITATIVO
Análisis cualitativos, es decir, determinar la presencia de ciertas sustancias. Por ejemplo, la determinación del
contenido de DOBI y caroteno en aceites y grasas comestibles, la identificación de contaminación, como el cromo y el
hierro en el agua,la identificación de la cianocobalamina y la comprobación de la pureza del ADN/ARN.
Análisis cuantitativos, es decir, determinar las cantidades de ciertas sustancias. Por ejemplo, la determinación de la
concentración de sustancias en el agua, como la DQO o el amoníaco, la determinación de la unidad de amargor de las
bebidas alcohólicas, la medición del contenido de azúcar en las bebidas y la cuantificación de las proteínas.

Aplicaciones de la espectroscopia ultravioleta visible

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