Vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU............................................................................................................................................... 1
I. TÌNH HÌNH NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM................................... 2
II. MỘT SỐ VI SINH VẬT CÓ THỂ GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM.............................................. 6
2.1 Salmonella......................................................................................................................6
2.2 Campylobacter ...............................................................................................................6
2.3 Clostridium perfringens .................................................................................................7
2.4 Clostridium.....................................................................................................................7
2.5 Staphylococcus ...............................................................................................................8
2.6 Vibrio spp .......................................................................................................................9
2.7 Escherichia coli............................................................................................................10
2.8 Shigella.........................................................................................................................10
2.9 Listeria monocytogenes................................................................................................11
2.10 Các virus gây bệnh trong thực phẩm .........................................................................12
2.11 Coliforms....................................................................................................................13
2.12 Nấm men và nấm mốc................................................................................................13
III. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT............................................................... 15
3.1 Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp đếm trực tiếp.............................................15
3.1.1 Đếm bằng buồng đếm hồng cầu............................................................................15
3.1.2 Kỹ thuật đếm Breed...............................................................................................17
3.1.3 Đếm bằng kính hiển vi huỳnh quang.....................................................................18
3.2 Các kỹ thuật định lượng vi sinh vật trong mẫu bằng phương pháp nuôi cấy...............19
3.2.1 Phương pháp đếm khuẩn lạc .................................................................................20
3.2.2 Phương pháp ước đoán số lượng vi sinh bằng kỹ thuật MPN (Most Probable
Number): ........................................................................................................................28
3.2.3 Phương pháp lai khuẩn lạc ....................................................................................29
3.3 Phương pháp đo độ đục................................................................................................31
IV. ÁP DỤNG ĐỐI VỚI MỘT SỐ VI SINH VẬT GÂY BỆNH TRONG THỰC PHẨM ............... 32
4.1 Định lượng Fecal Coliform và E. Coli bằng phương pháp đếm đĩa ............................32
4.2 Định lượng Vibrio Parahaemolyticus ..........................................................................33
4.3 Định lượng Coliforms, Coliforms chịu nhiệt, E. Coli giả định (Fecal Coliforms) bằng
phương pháp MPN .............................................................................................................35
4.4 Định lượng Enterococci đường ruột trong nước bằng phương pháp màng lọc ...........37
Thiết bị: ..........................................................................................................................37
4.5 Định lượng Clostridium khử sunfite trong nước bằng phương pháp tăng sinh trong môi
trường cấy lỏng...................................................................................................................38
KẾT LUẬN........................................................................................................................................ 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................................41
PHỤ LỤC...........................................................................................................................42

http://www.ebook.edu.vn 1
MỞ ĐẦU
Các vi sinh vật gây bệnh nhiễm trong thực phẩm thường gặp gồm các vi
khuẩn Salmonella Shigella, E.coli, Bibrio choterea, Clostridium botulinum,
Clostridium perfringens; các vius Hepatis, virus Hepatis virus A, Rotavirus;
các ký sinh trùng Amip, sán lá gan, sán bò, trùng lông; các nấm mốc và nấm
men Aspergillus, candida, Furanium...
Vi sinh vật gây bệnh nhiễm trong thực phẩm bằng 4 con đường chính: qua
súc vật, qua môi trường, chế biến và bảo quản. Mức độ nguy hiểm và triệu
chứng của bệnh có thể gây nên do độc tố của vi sinh vật tiết vào thực phẩm hay
do chính tế bào của chúng gây nên. Để có thể gây ngộ độc thực phẩm, vi sinh
phải hiện diện với số lượng tế bào lớn và phụ thuộc liều lượng của từng chủng
loại nhiễm vào, thực phẩm phải có các đều kiện lý hoá thích hợp cho vi sinh vật
đó phát triển, nhiệt độ và thời gian phải thích hợp cho quá trình tăng trưởng của
chúng từ khi chúng nhiễm vào cho đến khi tiêu thụ để vi sinh vật nhân lên đến
đủ liều lượng hay sản xuất đủ lượng độc tố gây hại. Khi nhiễm thực phẩm, vi
sinh vật gây hư hỏng làm thực phẩm bị đổi màu, đổi vị, có mùi. Tuy nhiên cũng
có một số loại gây nhiễm thực phẩm nhưng không làm thay đổi màu, mùi, vị
hay hình dạng bên ngoài của thực phẩm. Vì vậy rất khó nhận biết bằng cảm
quan. Do đó, việc xác định và định lượng các vi sinh vật gây bệnh nhiễm trong
thực phẩm là điều rất cần thiết.

I. TÌNH HÌNH NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM TRÊN
THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM
Ở các nước phát triển có tới 10% dân số bị ngộ độc thực phẩm và mắc
bệnh truyền qua thực phẩm mỗi năm; với các nước kém phát triển tỷ lệ này cao
hơn nhiều. Nhiều nước có quy định báo cáo nhưng chỉ đạt 1% số ca bị ngộ độc
thực phẩm. Ngộ độc thực phẩm ở Mỹ chiếm 5% dân số/năm (>10 triệu ngư-
ời/năm), trung bình 175 ca/100.000 dân, mỗi năm chết 5.000 người; ở Anh: 190
ca/100.000 dân; ở Nhật: 20-40 ca/100.000 dân; ở Úc là 4,2 triệu ca/năm.
Thực trạng vi phạm vệ sinh an toàn thực phẩm ở nước ta rất đáng báo
động. Ngộ độc thực phẩm cấp tính trong những năm qua vẫn có chiều hướng
gia tăng cả về số vụ và quy mô mắc. Tỷ lệ mắc/100.000 dân trung bình từ năm
2001 – 2005 là 5,48. Có nhiều nguyên nhân gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm
trong toàn quốc như thực phẩm ô nhiễm, môi trường ô nhiễm; thực phẩm có
độc; điều kiện sản xuất, chế biến thực phẩm không bảo đảm an toàn, nhận thức
– hành vi đúng về phòng chống ngộ độc thực phẩm của cộng đồng còn nhiều
hạn chế…
Trung bình mỗi năm có 202.2 vụ ngộ độc thực phẩm xảy ra với 5.525,1
người mắc và 55.2 người chết. Số vụ ngộ độc xảy ra nhiều nhất là từ tháng 4 - 7
và tháng 9 – 11. Tỷ lệ mắc ngộ độc trung bình là 7.14/100.000 dân, tỷ lệ chết là
0,06/100.000 dân/năm.
Số vụ ngộ độc lớn (≥ 30 người) chiếm 26,8% với số mắc chiếm 83,2%.
Vụ ngộ độc nhỏ và vừa (<30 người) chiếm 73,2% với số mắc chiếm 16,8%. Tỷ
lệ mắc ngộ độc chiếm 18.7% tổng số đối tượng cùng ăn chung bữa ăn; tỷ lệ
chết là 0,8% tổng số đối tượng bị mắc ngộ độc thực phẩm. Mọi lứa tuổi đều có
thể bị ngộ độc, tuổi nhỏ (0 - 4 tuổi) và tuổi cao ≥ 50 có nguy cơ mắc và chết
cao do ngộ độc Biểu hiện chung trong các vụ ngộ độc là buồn nôn (81,0%), nôn
(83,9%), đau bụng chiếm 79.0%, ỉa chảy 72.2 %, đau đầu chiếm 53.2%, chóng
mặt 43,4%, sốt 26,3%….
Cơ sở nguyên nhân ngộ độc chủ yếu là gia đình (54,6%), bếp ăn tập thể
(15,6%), đám cưới/giỗ (16,6%), thức ăn đường phố (5,4%), bếp ăn trường học
(4,0%). Thức ăn nguyên nhân chủ yếu là thực phẩm hỗn hợp (40,0%); thuỷ sản
14,1%; nấm 13,2%; ngũ cốc và các sản phẩm là 7,8%…
Nguyên nhân ngộ độc chủ yếu là nguyên nhân vi sinh vật (34,0%), độc tố
tự nhiên (24,0%), hoá chất (10,0%). Còn 32,0% số vụ không xác định được
nguyên nhân. Vi sinh vật gây ngộ độc là Salmonella, Streptoccocus, E.coli,
Staphylococcus aurerus và Vibrio parahaemolyticus; độc tố tự nhiên chủ yếu là
độc tố của nấm độc (13,2%).

Thời gian báo cáo trung bình của vụ ngộ độc là 9.74 ngày. Với vụ ngộ độc
thực phẩm ≥30 người là 8.53 ngày (0-31 ngày), với vụ ngộ độc <30 người là
10,20 ngày (1-37 ngày).
Lấy mẫu xét nghiệm nguyên nhân vụ ngộ độc đạt tỷ lệ rất thấp: Mẫu thực
phẩm là 47,3%, mẫu bệnh phẩm là 23,9 %; dụng cụ, bao gói đạt tỉ lệ thấp 1,5 %
các vụ ngộ độc.
Bảng 1: Số lượng các vụ ngộ độc thực phẩm toàn quốc từ năm 2000 – 2008
Kết quả điều tra
Năm
Vụ ngộ độc (vụ) Số mắc (người) Chết (người)
2000 213 4233 59
2001 245 3901 63
2002 218 4.984 71
2003 238 6.428 37
2004 145 3.584 41
2005 144 4.304 53
2006 165 7.135 57
2007 247 7.329 55
2008 205 7.828 61
Trung bình/năm 202.2 (247 - 144) 5.525,1 (7.828 - 3.584) 55.2 (71 – 31)
Tổng cộng 1.820 49.726 497
Bảng 2. Tình hình ngộ độc tại Hà Nội trong 3 năm gần đây
Số vụ ngộ độc Nguyên nhân gây ngộ độc
Năm Số
vụ
Số
người
mắc
Số
người
chết
Vi sinh
vật
Thực
phẩm
biến
chất
Hóa
chất
tồn dư
trong
thực
phẩm
Độc tố
tự
nhiên
Nguyên
nhân
khác
2006 2 41 0 2 0 0 0 0
2007 8 137 0 7 0 1 0 0
2008 8 354 0 8 0 0 0 0
Cộng 18 620 0 17 0 1 0 0

Bảng 3: Nguyên nhân trong các vụ ngộ độc thực phẩm trong năm 2007
Kết quả điều tra
TT Nguyên nhân ngộ độc
Số lượng Tỷ lệ (%)
1 Salmonella 3 1.5
2 Streptoccocus 2 1.0
3 E.coli 4 2.0
4 Staphylococcus aurerus 7 3.4
5 Vibrio parahaemolyticus 1 0.5
6 Thuốc diệt chuột 0 0.0
7 Hoá chất 1 0.5
8 Độc tố của cá nóc 8 3.9
9 Độc tố con so 2 1.0
10 Độc tố của con sam 2 1.0
11 Độc tố trong thịt cóc 2 1.0
12 Độc tố Histamin 3 1.5
13 Độc tố trong mắm tép 0 0.0
14 Độc tố trong rượu 5 2.4
15 Độc tố của Lá ngón 2 1.0
16 Nấm độc 27 13.2
17 Không rõ nguyên nhân 136 66.3
Tổng cộng 205 100,0

Salmonella Shigella E. coli Vibrio
Staphylococcus Campylobacter Clostridium Listeria

II. MỘT SỐ VI SINH VẬT CÓ THỂ GÂY NGỘ
ĐỘC THỰC PHẨM
2.1 Salmonella
Salmonella Trước năm 1983 các nhà khoa học chia Salmonella ra làm 3
loài dựa theo phản ứng sinh hóa mà chúng tham gia : S.typhi, S.choleraesuis,S.
enteridis.
Salmonella là trực khuẩn garm (-), hiếu khí và kị khí tùy ý, có khả năng di
động không tạo bào tử, lên men glucose và manitol sinh acid nhưng không lên
men sacarose và lactose, không sinh indole, không phân giải urê không có khả
năng tách nhóm amin từ tryptophane, hầu hết các chủng đều sinh H2S. pH tối
ưu cho chúng phát triển nằm trong vùng trung tính, tuy nhiên đôi khi phát triển
trong vùng pH từ 4 ÷ 9, không có khả năng phát triển ở nồng độ muối cao.
Vi khuẩn Salmonella tồn tại trong cơ thể nhiều loài động vật và có thể gây
bệnh cho ngườI. Vi khuẩn Salmonella có thể gây bệnh truyền nhiễm cho động
vật như phó thương hàn bò, phó thương hàn lợn, bệnh sẩy thai cừu và ngựa,
bệnh bạch lỵ gà, bệnh viêm ruột bò,… Những bệnh kể trên do Salmonella gây
ra người ta gọi là bệnh truyền nhiễm nguyên phát, ngoài ra có thể phá hiện
được Salmonella trong chất bài tiết của động vật.
Số lượng Salmonella đủ để gây ngộ độc là khi chúng hiện diện cả triệu tế
bào trong một gam thực phẩm. Các triệu chứng do Salmonella gây ra thường là
tiêu chảy, ói mửa, buồn nôn. Thời gian ủ bệnh cho đến khi các triệu chứng biểu
hiện thường sau 12-36 giờ kể từ khi tiêu thụ thực phẩm bị nhiễm. Triệu chứng
thường kéo dài ít nhất từ 2-7 ngày. Không phải tất cả mọi người khi tiêu thụ
thực phẩm bị nhiễm Salmonella điều có biểu hiện bệnh, ngược lại một số người
không có triệu chứng lâm sàng khi tiêu thụ phải thực phẩm nhiễm vi sinh vật
này khi đó chúng được bài tiết ra ngoài. Các loại thực phẩm có nguy cơ bị
nhiễm Salmonella như thịt gia cầm, sản phẩm thịt, trứng và các sản phẩm của
trứng, thủy sản. Nguồn nhiễm vi sinh vật vào các loại thực phẩm thường có
nguồn gốc từ đường ruột của người và các loài động vật, chúng có thể được
nhiễm gián tiếp hay trực tiếp. Salmonella gây nên bệnh sốt thương hàn thuộc
các serotype Salmonella typhi, Salmonella paratyphi A, B, C. các dòng này
thường không gây bệnh cho các loài động vật.
2.2 Campylobacter
Đây là vi sinh vật gây nên bệnh viêm nhiễm đường ruột, bằng các phương
pháp phân lập đã chứng minh vi sinh vật này hiện diện khắp nơi.
Campylobacters là một trong những hệ vi sinh vật của nhiều loại động vật và
chim. Nhưng các dòng có khả năng gây ngộ độc thực phẩm không thể phát
triển khi nhiệt độ thấp hơn 300
C, đây là vi sinh vật ưa nhiệt bắt buột. Sản phẩm

sữa và thịt gia cầm là những nguồn có thể gây nên ngộ độc do vi sinh vật này.
Nước cũng là một trong những nguồn mang bệnh này. Campylobacters là vi
sinh vật rất nhạy với nhiệt độ, chúng bị tiêu diệt hoàn toàn bằng phương pháp
thanh trùng Pasteur, chúng không thể sống sót trong thực phẩm có môi trường
acid. Chúng không thể phát triển trong thực phẩm bảo quản trong điều kiện
hiếu khí mà chỉ phát triển trong các loại thực phẩm hút chân không.
Khi xâm nhiễm Campylobacter, thời gian ủ bệnh thường từ 2-11 ngày.
Các triệu chứng do vi sinh vật này gây nên như đau nhức, tiêu chảy, sốt, đau
đầu, khó chịu, chuột rút, lạnh cóng, mê sản. Thỉnh thoảng có những biểu hiện
bệnh giống như cảm cúm.
2.3 Clostridium perfringens
Quan niệm về sự ngộ độc thực phẩm do Clostridium perfringens gây ra đã
có những thay đổi trong những năm gần đây. Theo những quan niệm trước đây
cho rằng các dòng C.perfringens kháng nhiệt, tạo bào tử và không làm tan máu
mới có thể gây ngộ độ thực phẩm. Nhưng trong những năm gây đây các dòng
nhạy cảm với nhiệt, không làm tan máu cũng được tìm thấy trong các vụ ngộ
độc do vi sinh vật này gây nên.
Vì các bào tử của C. perfringen kháng nhiệt nên chúng thường sống sót
qua quá trình nấu chín. Tuy nhiên cũng phụ thuộc vào thời gian tiếp xúc với
nhiệt. Nếu những bào tử sống sót, khi gặp điều kiện thích hợp chúng sẽ nẩy
mầm và nhân lên. Khi đun nấu thức ăn ở nhiệt độ thấp và thời gian ngắn có thể
làm cho các dòng kháng nhiệt tồn tại vì thế chúng sẽ gây tái nhiễm sau khi bảo
quản. Các nguồn thực phẩm có thể gây ngộ độc với các vi sinh vật này thường
là thịt gia cầm, nhất là các loại gia cầm lớn đông lạnh sâu, thịt trong các hầm
chứa. C. perfringens cũng được tìm thấy trong đất, trong phân người và trong
các loại thực phẩm khác. Các triệu chứng do vi sinh vật này gây ra thường là
đau thắt vùng bụng, tiêu chảy. Thời gian ủ bệnh từ 12-24 giờ. Các triệu chứng
lâm sàng gây nên do độc tố của chúng.
2.4 Clostridium
Clostridium là các vi khuẩn garm (+), hình que, kị khí sinh bào tử , không
di động, có thể thủy giải saccaride và protein trong các hoạt động thu nhận
năng lượng tạo ra các sản phẩm như acid acetic, butiric, rượu, tạo ra các mùi
khó chịu trong sản phẩm. Clostridium phát triển mạnh ở nhiệt độ 55o
C, nhiệt độ
tối ưu là 43 ÷ 47o
C. Nhiệt độ 15 ÷ 20o
C làm chậm hoặc làm ngưng sự phát triển
của vi khuẩn này. Không phát triển ở pH hơn 5,0 hoặc trên 9,0, bị ức chế bởi
5% NaCl. Clostridium hiện diện trong đất, một số loài trong nhóm này gây
bệnh cho người và động vật, một số loài khác gây hư hỏng thực phẩm, khử
sunphit thành sunphur tạo ra màu đem và gây mùi khó chịu.

Clostridium botulinum là vi sinh vật sinh độc tố gây bệnh ngộ độc thịt cho
người (botulism). Bệnh biểu hiện rất nghiêm trọng ở người. Bệnh gây ra do độc
tố được hình thành bởi C.botulinum nhiễm trong thực phẩm. Triệu chứng lâm
sàng của bệnh là ói mửa, buồn nôn, sau đó có những biểu hiện rối loạn thành
kinh như choáng váng, rối loạn thị giác, rối loạn các cơ ở cổ và miệng, đau ở
vùng ngực, khó thở và tê liệt, có thể dẫn đến tử vong. Các triệu chứng trên biểu
hiện sau 12-36 giờ sau khi tiêu thụ thục phẩm nhiễm độc tố. Các triệu chứng
thường kéo dài 2-6 ngày tuỳ theo tình trạng nhiễm độc và sức khoẻ củng từng
bệnh nhân.
Các loại thực phẩm như thịt, rau quả không được bảo quản đúng qui định
hay lây nhiễm từ đất, phân động vật hay do chế biến không đủ nhiệt độ trước
khi dùng, các sản phẩm đóng hộp không đúng qui cách cũng có nguy cơ nhiễm
vi sinh vật này rấy cao. Điều kiện thích hợp cho việc hình thành độc tố của vi
sinh vật này điệu kiện môi trường kỵ khí, pH trung tính, không có các vi sinh
vật khác cạnh tranh. Độc tố botuline do C. botulinum tiết ra gồm một số loại
khác nhau như A, B, C1, C2, D, E, F, G. các độc tố này là những protein có
trọng lượng phân tử lớn khoảng 1 triệu danton. Nhưng những dạng có tác động
mạnh đến con người là A, B, và E. đây cũng là một trong những loại độc tố
sinh học có cường độ mạnh nhất. Trong những năm gầy đây, các vụ ngộ độc
botulism gây ra do C.botulinum dòng E thường được phát hiện khi tiêu thụ cá
và các sản phẩm thủy sản. Dòng vi sinh vật này thường xuyên phân lập được từ
các mẫu bùn đáy tại các cửa sông.
2.5 Staphylococcus
Staphylococcus là loại cầu khuẩn gram (+), các tế bào của chúng liên kết
thành hình chùm nho. Khi phát triển trong môi trường, Staphylococcus có khả
năng tạo ra sắc tố từ màu trắng đến vàng sậm, nhiệt độ 20 ÷ 25o
C thích hợp
nhất cho chúng tạo màu. Staphylococcus không di động, không tạo bào tử,
nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển là 37o
C, chịu được sự khô hạn, hơi nóng (ở
nhiệt độ 50o
C chúng vận sống trong 30 phút), có khả năng sống ở nồng độ
muối 9 ÷ 10%. Staphylococcus phát triển ở pH rất rộng (pH = 4,0 ÷ 9,8).
Khoảng pH tối ưu của chúng là 6 ÷ 7 và aw tối ưu khoảng 0,83 ÷ 0,86.
Staphylococcus có khả năng lên men và sinh acid từ manitol, trehalose,
sucrose. Staphylococcus được phân bố khắp nơi nhưng chủ yếu được phân lập
từ da và màng nhầy của người và động vật máu nóng. Staphylococcus có thể
nhiễm vào trong thực phẩm qua con đường tiếp xúc với người thao tác trong
quá trình chế biến thực phẩm. Sự hiện diện với mật độ cao của Staphylococcus
trong thực phẩm chỉ thị điều kiện vệ sinh và kiểm soát nhiệt độ kém của quá
trình chế biến.
Staphylococcus aureus là VSV có khả năng sản sinh một số loại độc tố
đường ruột bền nhiệt, không bị phân huỷ khi đun ở 100o
C trong khoảng 30

phút. Khi vi sinh vật này xâm nhiễm vào trong thực phẩm, chúng tiết độc tố
vào trong sản phẩm và gây độc. Khi con người tiêu thụ loại thực phẩm có chứa
độc tố này, sau 4-6 giờ ủ bệnh sẽ bộc phát các triệu chứng lâm sàng như tiêu
chảy, nôn mữa, các triệu chứng này kéo dài từ 6-8 giờ. Các loại thực phẩm có
chứa hàm lượng muối cao thường có nguy cơ nhiễm vi sinh vật này như
jambon, kem tổng hợp, nước soup… vì các loại thực phẩm này ít khi được xử
lý ở nhiệt độ cao hơn 40o
C. Các loại thuỷ sản hay thực phẩm đóng hộp cũng
thường hay bị nhiễm loài vi sinh vật này. Các nguồn lây nhiễm vào thực phẩm
chủ yêu từ các khâu chế biến trong nhà bếp. Trong tự nhiên các vi sinh vật này
thường tình thấy trên da, mũi, tóc hay lông của các loài động vật máu nóng.
2.6 Vibrio spp
Các loài Vibrio có nguồn gốc từ biển, chúng cần ion Na+ để phát triển.
Giống Vibrio có một số loài có khả năng gây bệnh cho người như V. cholerae,
V. parahaemolyticus, V. vulnificus, V. hollisae, V. furnsii, V. mimicus, V.
fluvialis, V. alginolyticus.
V. cholerae là tác nhân gây nên các vụ dịch tả trên toàn thế giới. Loài vi
sinh vật này được chia thành hai kiểu huyết thanh chính đó là O1 và non-O1,
kiểu huyết thanh O1 bao gồm ba kiểu huyết thanh phụ như sau: Ogawa; Inaba
(hai kiểu này được gọi chung là kiểu cổ điển – Classic) và kiểu Eltor (kiểu
Eltor còn được gọi là kiểu O139). Hai kiễu huyết thanh Inaba và Ogawa ngày
nay chỉ còn được tìm thấy tại các nước thuộc khu vực châu A. Trong khi đó các
vụ dịch tả trên khắp thể giới gây ra do kiểu Eltor. Khi có các trận dịch do V.
cholerae gây ra thường lan truyền rất nhanh vào trong nước, gây nhiễm vào
thực phẩm, nếu điều kiện vệ sinh kém, vi khuẩn sẽ lan truyền qua con người và
dịch bệnh càng thêm nghiêm trọng. Vi sinh vật này sản sinh độc tố
cholaratoxin, đây là loại độc tố đường ruột có cường độ mạnh, chỉ cần 5µg gây
nhiễm qua đường miệng có thể gây tiêu chảy cho người trưởng thành. Một số
độc tố khác cũng được vi sinh này tiết ra như hemolysine có độc tính tương tự
tetrodotoxin (độc tố cá nóc) hay độc tố tương tự shiga-toxin.
Các loại thực phẩm có thể lan truyền V. cholerae như nước uống, nước
trái cây, rau quả, sữa và các sản phẩm sữa, thậm chí bia cũng có khả năng
nhiễm vi sinh vật này. Các loại sản phẩm thuỷ sản tươi sống, không qua gia
nhiệt, gia nhiệt nhẹ hay do sự nhiễm chéo sau khi gia nhiệt cũng được khuyến
các là có nguy cơ mang V.cholerae khá nghiêm trọng.
V. parahaemolyticus là loài vi sinh vật tồn tại và phát triển trong môi
trường có hàm lượng muối cao, chúng thường xuyên được phân lập từ các sản
phẩm thủy sản, trong các vùng nước ấm ven bờ biển. Chúng sản sinh độc tố
hemolysine bền nhiệt, chất này chịu trách nhiệm cho đặc tính kháng nguyên
Kanagawa. Nhưng trong những năm gần đây các dòng V.parahaemolyticus có
phản ứng Kanagawa âm tính cũng có thể gây bệnh. Triệu chứng biểu hiện của

bệnh có thể xuất hiện trong khoảng 2-96 giờ sau khi tiêu thụ thực phẩm bị
nhiễm, thời gian này phụ thuộc vào liều lượng xâm nhiễm và thể trạng của từng
bệnh nhân, loại thực phẩm tiêu thụ và hàm lượng acid trong dạ dày. Các biểu
hiện bệnh lý khi vi sinh vật này xâm nhiễm và đau thắt vùng bụng, viêm nhiễm
đường ruột và tiêu chảy nhẹ.
Các loài Vibrio khác khi xâm nhiễm vào trong thực phẩm cũng có thể gây
nên các bệnh đượng ruột và có biểu hiện bệnh lý tương tự như hai loài trên. Dĩ
nhiên tuỳ từng loài và liều lượng mà có những biều hiện bệnh nặng nhẹ khác
nhau. Chỉ riêng loài V. vulnificus không gây các triệu chứng bệnh đường ruột
mà chúng gây nhiễm trùng máu cho người.
2.7 Escherichia coli
E.coli thuộc họ Enterbacteriaceae, catalose (+), oxidase (-), gram (-), trực
khuẩn ngắn, không tạo bào tử, chịu được nhiệt, không bị hủy khi đun nóng
100oC trong 2 giờ. E.coli có thể kháng cồn, không bị hủy khi tiếp xúc với cồn
50%, bị hủy bởi focmol 5%, có khả năng phát triển ở nhiệt độ từ 30 ÷ 50o
C,
nhiệt độ phát triển tối ưu của chúng là 37o
C, phát triển ở pH tối ưu là 4,4 và aw
tối ưu là 0,95.
E. coli là vi sinh vật hiếu khí phổ biến trong đường tiêu hoá của người và
các loài động vật máu nóng. Hầu hết các dòng E. coli tồn tại một cách tự nhiên
và không gây hại trong đường tiêu hoá, ngược lại chúng còn đóng vai trò quan
trọng trong việc ổn định sinh lý đường tiêu hoá. Tuy nhiên có ít nhất 4 dòng
sau đây có thể gây bệnh cho người và một số loài động vật:
Enterobathogenic E. coli (EPEC)
Enterotocigenic E. coli (ETEC)
Enteroinvasive E. coli (EIEC)
Enterohaemorrhagic E.coli (EHEC)/ verocytocin E.coli (VTEC) hay Ecoli
O157: H7
Các dòng E. coli gây bệnh khi chúng xâm nhiễm vào người qua con
đường thực phẩm có thể gây nên các bệnh rối loạn đường tiêu hoá, các biểu
hiện lâm sàng biến động có thể từ nhẹ đến rất nặng, có thể đe doạ mạng sống
của con người phụ thuộc vào liều lượng, dòng gây nhiễm và khả năng đáp ứng
của từng người.
2.8 Shigella
Giống Shigella cũng là một thành viên của họ vi khuẩn đường ruột
Enterobacteriacae, chúng gồm có 4 loài sau: S. dysenteriae, S. sonnei, S.
plexneri, S. boydii. Đây là giống vi sinh vật có tế bào chủ đặc hiệu, chúng chỉ
thích nghi và phát triển trong tế bào chủ là người và các loài linh trưởng. Sự
hiện diện của chúng trong môi trường là do sự nhiễm phân của người và các
loài mang vi sinh vật này. Shigella có thể tồn tại hơn 6 tháng trong môi trường

nước. Các vụ ngộ độc thực phẩm do Shigella gây ra chủ yếu tập trung ở các
nước kém phát triển, chế biến thực phẩm trong điều kiện kém vệ sinh. Bệnh
cũng có thể truyền trực tiếp từ người qua người.
Shigella chủ yếu gây nên các bệnh lị trực trùng. Thời gian ủ bệnh sau khi
tiêu thụ thực phẩm bị nhiễm là 1-7 ngày. Các biểu hiện triệu chứng bệnh có thể
nhẹ, biểu hiện không rõ, chỉ thoáng qua như tiêu chảy nhẹ, nhưng đôi khi cũng
có những biểu hiện nghiêm trọng như đi tiêu ra máu, có những mảnh niêm mạc
ruột, mất nước, sốt cao và bị co rút thành bụng. Các triệu chứng trên có thể kéo
dài 12-14 ngày hay lâu hơn. Đối với người lớn, các trường hợp tử vong do
Shigella hiếm khi diễn ra, nhưng bệnh biểu hiện rất nghiêm trọng đối với trẻ
em và người già. Hàng năm có khoảng nửa triệu người tử vong do vi sinh vật
gây ra trên khắp thế giới.
Sự lây nhiễm vi khuẩn Shigella chủ yếu đường miệng. Nước là một môi
trường truyền bệnh quan trọng, đặc biệt ở những nơi kém vệ sinh. Tuy nhiên
các loại thực phẩm cũng là nguyên nhân gây nên các bệnh do Shigella. Vi sinh
vật này nhiễm vào thực phẩm qua nguyên liệu hay quá trình chế biến. Ðôi khi
nhiễm bệnh do vệ sinh cá nhân kém.
2.9 Listeria monocytogenes
Trong những năm gần đây L. monocytogenes nổi lên như một một tác
nhân gây bệnh nguy hiểm. Đối tượng gây bệnh của vi sinh vật này là trẻ em,
phụ nữ mang thai hay những người già. Đối với những vi sinh vật gây bệnh gộ
độc thức phẩm khác, chúng bộc phát bệnh khi con người hấp thu đủ liều lượng,
sau thời gian ủ bệnh các triệu chứng lâm sàng biểu hiện. Ngược lại L.
monocytogenes hiện diện với một số lượng nhỏ trong thực phẩm, khi được đưa
vào cơ thể, chúng tồn tại và chơ cơ hội. Khi có điều kiện thuận lợi, chúng nhân
lên xâm nhiễm vào các mô sâu và gây bệnh. Các bệnh do vi sinh vật này gây
nên bắt đầu từ đường tiêu hoá như tiêu chảy, sốt nhẹ. Sau đó chúng xâm nhiễm
vào các đại thực bào gây nên bệnh nhiễm trùng máu, tác động lên hệ thần kinh
trung ương, tim mắt, và có thể xâm nhập vào bào thai gây nên sẩy thai, đẻ non
hay nhiễm trùng thai nhi.
L. monocytogenes thuộc loại vi sinh vật ưa lạnh, chúng có thể phát triển ớ
nhiệt độ từ 2-44o
C. Chúng thường được phân lập từ các loại thực phẩm như
phomat sữa, thịt cá rau quả và thậm chí phân lập được từ trong nước mặt.
Trong tất cả các công đoạn chế biến thực phẩm, sữa hay rau quả đều có khả
năng xâm nhiễm vi sinh vật vật này. Đặt biệt trong công đoạn bảo quản các sản
phẩm ớ nhiệt độ thấp, vi sinh vật này có cơ hội phát triển thành số lượng lớn.
Các sản phẩm thanh trùng Pasteur và được bảo quản ớ nhiệt độ thấp trong các
tủ lạnh có nguy cơ nhiễm vi sinh vật này rất cao.

2.10 Các virus gây bệnh trong thực phẩm
Các đợt dịch bệnh gây ra từ thực phẩm do tác nhân virus cho đến nay vẫn
là vấn đề bí ẩn. Nhưng một số tác giả vẫn tin rằng virus trong thực phẫm là tác
nhân gây nên các bệnh hiễm nghèo. Những tiến bộ trong các nhiên cứu về virus
thưc phẩm vẫn còn hạn chế. Cho dến nay các đặc điểm sinh lý của virus đường
ruột vẫn còn biết rất hạn chế. Cho đến nay các phương pháp nuôi cấy để phát
hiện virus trong thực phẩm cho đến nay vẫn chưa thể thực hiện được. Nhưng
với các tiến bộ về kỹ thuật sinh học phân tử như kỹ thuật lai phân tử, kỹ thuật
PCR có thể phát hiện được các virus có hại cho con người trong thực phẩm.
Sự lan truyền virus cho người qua con đường thực phẩm được biết từ
những năm 1950. Các virus gây bệnh đường ruột cho người chủ yếu có nguồn
gốc từ các sản phẩm thuỷ sản. Cho đến nay được biết có khoảng hơn 100 loại
virus đường ruột. Nhưng chỉ một vài loài trong số đó có khả năng gây bệnh cho
người. Theo Kilgen và Cole (1991) các loài virus sau đây có thể gây nguy hiểm
cho người.
Hepatitis type A (HAV)
Virus Norwalk
Calicivirus
Astrovirus
Virus NonA và Non B.
Virus tồn tại ở thể không hoạt động khi ở bên ngoài tế bào, chúng không
thể tự nhân lên trong nước hay trong các sản phẩm thực phẩm cho dù ở bất kỳ
điều kiện hoá lý như thế nào. Chúng xâm nhiễm vào thực phẩm hoàn toàn do
quá trình chế biến, từ nước bị ô nhiễm. Các loài nhuyễn thể ăn lọc có khả năng
tích luỹ nhiều virus trong nước. Hàng ngày một con nguyễn thể có thể lọc 1500
lít nước, theo đó một số lượng lớn virus có thể vào cơ thễ của con vật này và
tích luỹ tại đó. Vì thế mật độ virus trong cơ thể nhuyễn thể cao hơn rất nhiều so
với môi trường nước chúng đang sinh sống.
Liều lượng gây bệnh của virus có thể thấp hơn rất nhiều so với vi khuẩn khi
con người tiêu thụ thực phẩm bị nhiễm. Liều lượng gây nhiễm tối thiểu của một
số loài vurus đường ruột tương đương với số lượng hiện diện trong thực phẩm
mà các phòng thí nghiện có thể phát hiện được bằng phương pháp nuôi cấy.
Cơ thể người và các loài động vật là nguồn chứa các virus đường ruột. Virus
được tìm thấy với số lượng lớn trong phân của những người bị nhiễm và tồn tại
trong nhiều ngày đến nhiều tuần. Sự nhiễm phân vào trong thực phẩm bằng con
đường gián tiếp hay trực tiếp là con đường xâm nhiễm virus vào thực phẩm.
Sự sống sót của virus trong môi trường hay trong thực phẩm phụ thuộc
vào yếu tố như nhiệt độ, nồng độ muối, cường độ bức xạ mặt trời hay sự hiện
diện của các thành phần hữu cơ khác. Virus đường ruột cũng có khả năng tồn

tại nhiều tháng trong nước biển ở nhiệt độ < 10o
C thậm chí có thể lâu hơn. Vì
thế đây cũng là nhân tố chỉ thị ô nhiễm phân. Tất cả các virus đường ruột đều
kháng với acid, các enzym thủy giải, hay muối mật có trong đường tiêu hoá.
Một số virus có thể kháng nhiệt như Hepatits type A, một số khác có thể kháng
với các chất tẩy uế như phenolic, ethanol …. Ozon và chlorine là những tác
nhân có thể làm bất hoạt một vài loại virus đường ruột.
Để ngăn ngừa các bệnh do virus từ thực phẩm, các loại thức ăn phải được
nấu chín,khử virus trước khi tiêu thụ, các loại nhuyễn thể ăn lọc phải được khai
thác tronng những vùng nước không nhiễm virus hay được nuôi trong các vùng
nước sạch trước khi tiêu thụ.
2.11 Coliforms
Coliforms là những trực khuẩn hình gậy, gram âm (-), không sinh bào tử,
hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý. Chúng có khả năng phát triển ở nhiệt độ rất rộng từ
-2o
C đến 50o
C, pH trong khoảng 4,4 ÷ 9,0. Coliforms có khả năng lên men
lactose sinh acid và sinh hơi ở 37o
C trong 24 ÷ 48giờ.
Coliforms hiện diện rộng rãi trong tự nhiên trong ruột người, động vật.
Khi số Coliforms của thực phẩm cao thì khả năng hiện diện của các vi sinh vật
gây bệnh khác cũng cao….
Coliforms chịu nhiệt là những Coliforms có khả năng lên men lactose sinh
hơi trong khoảng 24 giờ khi được ủ ở 44o
C tromg môi trường canh EC.
Coliforms phân là Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh indole khi được ủ
khoảng 24 giờ ở 45,5o
C trong canh Trypton. Coliforms phân là một thành phần
của hệ vi sinh vật đường ruột ở người và các động vật máu nóng khác và được
sử dụng để chỉ thị mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản, vận
chuyển thực phẩm, nước uống.
Căn cứ vào nhiệt độ vi sinh vật có thể phát triển để chia nhóm Coliform
thành hai nhóm. Nhóm Coliform có nguồn gốc từ phân của các loài động vật
và, nhóm này được gọi là Coliform phân và nhóm không có nguồn gốc từ phân
động vật. Trên thực tế, các phương pháp kiểm nghiệm chỉ xác định Coliform
phân là xác định nhóm coliform có nguồn ngốc từ ruột người và các động vật
máu nóng bao gồm các giống như Escherichia; Klebsiella và Enterobater.
2.12 Nấm men và nấm mốc
Nấm men và nấm mốc là nhóm vi sinh vật rất đa dạng, đây là nhóm vi
sinh vật nhân thật có vách tế bào và lớp vỏ chitin, có nhân và các bào quan
khác. Tất cả các loài nấm men và nấm móc đều thuộc nhóm vi sinh vật dị
dưỡng. Chúng chỉ có khả năng nhận các chất dinh dưỡng ở dạng hòa tan. Trong
quá trình trao đổi chất xảy ra ở tế bào chúng lại có khả năng chuyển hóa các
chất hòa tan thành các chất không hòa tan như lignocellulose,…. Ngoài ra,
chúng còn có thể tạo ra các chất độc, các chất độc của chúng được gọi chung là

độc tố vi nấm (mycotoxins). Tiêu biểu có Aspegillus flavus, Aspegillus
parasiticus, Aspegiluus moninus, Penicillium italicum, Penicillium digitatum,
Penicillium roquefortii, Penicillium cammenbertii. Trong thực phẩm nấm mốc
và nấm men hiện diện có thể tăng trưởng làm thay đổi màu của thực phẩm, làm
phát sinh muồi hay vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cơ cấu của thực phẩm, một
số có thể tạo độc tố gây ngộ độc thực phẩm.

III. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI
SINH VẬT
3.1 Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp đếm trực tiếp
Số lượng Vi sinh vật trong mẫu có thể được xác định bằng cách đếm trực
tiếp trên kính hiển vi. Qui trình đến trực tiếp cho phép xác định được số lượng
vi sinh vật với kết quả cao nhất. Mặt dù phương pháp đếm trực tiếp bằng kính
hiển vi cho phép ước lượng nhanh chóng số lượng vi sinh vật có trong mẫu.
Tuy vậy phương pháp này có những điểm hạn chế nhất định như không phân
biệt được số lượng tế bào sống và số lượng tế bào chết, dể nhầm lẫn tế bào vi
sinh vật với các mảnh vở nhỏ của mẫu và không cho phép tìm hiểu các đặc
điểm khác của của vi sinh vật được được quan sát.
3.1.1 Đếm bằng buồng đếm hồng cầu
Đối với các vi sinh vật có kích thước lớn như nấm men, nấm mốc, tảo và
protozoa, phương pháp đếm trực tiếp dễ dàng thực hiện với các loại buồng
đếm. Có rất nhiều loại buồn đếm vi sinh vật khác nhau phù hợp với từng thể
tích và kích thước của từng nhóm vi sinh vật. Ví dụ có thể sử dụng buồng đếm
hồng cầu Petroff – Hauser để đếm vi khuẩn. Đối với các mẫu nước và các mẫu
khác, buồng đếm Holber được sử dụng rộng rãi nhất.
Buồng đến Holber là một lam kính dày 2-3mm có một vùng đĩa đếm nằm
giữa lame kính vùng này được bao quanh bởi một rãnh. Đĩa đếm thấp hơn bề
mặt của lame kính khoảng 0,02mm, có hình tròn vì thế khi phủ lên trên bằng
kính đậy vật thì độ sâu của đĩa đếm sẽ đồng đều nhau. Vùng đĩa đếm có điện
tích 1mm2
và được chia thành 400 ô vuông nhỏ hơn, mỗi ô có diện tích
0.0025mm2
. thể tích của mỗi ô là 0,02 x 0,0025 mm2
, thể tích này tương đương
với 0,00005ml. Thêm vài giọt formalin vào trong những lọ chứa mẫu, trộn đều.
Pha loãng mẫu cần đếm sao cho trong mỗi ô nhỏ của buồng đếm có khoãng 5 -
10 tế bào vi sinh vật. Để đạt được độ pha loãng như vậy cần phải ước lượng
được số lượng vi sinh vật trong mẫu, đồng thời phải thử vài lần trong quá trình
pha loãng. Mẫu phải được pha loãng bằng dung dịch pha loãng chứa 0,1%
pepton và 0,1% laurylsulphat và 0,01% methyl blue. Tất cả các dung dịch pha
loãng đều phải cần lọc trước khi sử dụng.

Đặt một giọt mẫu được pha loãng vào trong đĩa đếm trên buồng đếm, đậy
bằng kính đậy vật. Tất cả các buồng đếm và kính đậy vật phải được lau thật
sạch. Thể tích mẫu chứa trong buồng đếm là khoảng không gian giữa đĩa đếm
và kính đậy vật, không để mẫu tràng ra bên ngoài rãnh của đĩa. Sau khi đạt
mẫu, để yên khoảng 5 phút để ổn định vị trí của các tế bào trong buồng đếm.
Đếm ngẫu nhiên khoảng 50-100 ô nhỏ. Tính trung bình số lượng vi khuẩn trong
tất cả các ô đã đếm. Sau đó nhân với 20 000 và với độ pha loãng mẫu trước khi
đếm để có được số lượng tế bào trong 1ml. Lặp lại hai lần hay nhiều hơn để lấy
giá trị số đếm trung bình. Đối với các vi sinh vật tụ thành từng cụm, không thể
phân biệt từng tế bào thì mỗi cụm được xem là một vi khuẩn.
Với những kinh nghiệm của mỗi cá nhân về độ pha loãng, thao tác kỹ
thuật thành thạo có thể nhận được các số đếm chính xác. Tuy vật kết quả có
chính xác hay không còn phụ thuộc vào sự sạch sẽ của buồng đếm, kính đậy
vật nhằm đảm bảo không có vi khuẩn khác không phải từ mẫu hiện diện trong
buồng đếm và trong kính đậy vật.
3.1.2 Kỹ thuật đếm Breed
Kỹ thuật này rất hữu ích trong việc xác định tổng số vi sinh vật bằng
phương pháp đếm trực tiếp. Lame kính Breed có một vùng có diện tích 1cm2
được đánh dấu trên lame. Dùng bơm tiêm, hay que cấy vòng cho 0,01ml mẫu
cần đếm vào trong vùng này, sấy khô bằng ngọn lửa sau đó nhuộm với methyl
blue. Khi đếm, cho dầu nhúng lên diện tích vùng cần đếm. Thông thường vùng
này có đường kính 0,16 mm. Diện tích vùng đếm là pr2 hay 3,14 x 0,08 x 0,08
= 0,02mm2. Với diện tích này chiếm 1/5000 trong tổng diện tích đặt mẫu là
100mm2 hay thể tích trong vùng đếm là 1/5000 x 0,01ml. Như vậy nếu có 1 vi
sinh vật trong vùng đếm thì tương đương với 5000/0,01ml hay 500 000 tế
bào/ml. Số đếm của các vi sinh vật trong các vùng khác nhau của vùng qui ước
được tính bằng công thức như sau:
4
2
Nx4x10
C =
dπ
d: đường kính vủa vùng đếm
N: số lượng tế bào trong 1 vùng
C: số tế bào trong 1ml
Khi sử dụng kính hiển vi huỳnh quang với các chất nhuộm khác như
acridin cam (AODC), 4’,6-dianidino-2-phenyl-indol (DAPI), fluorescein
isothiocyanate (FITC) cũng được sử dụng rộng rãi để đếm số lượng vi khuẩn.
Các nghiên cứu của K.G. Porter và Y.S. Feig cho thấy rằng khi sử dụng DAPI
để đếm số lượng vi khuẩn trong nước cho kết quả tốt hơn khi sử dụng chất
nhuộm AODC khi trong mẫu nước có nhiều chất dinh dưỡng và nhiều phiêu
sinh vật khác. Về độ bền tính phát huỳnh quang của DAPI cũng cao hơn

AODC. Hai tác giả trên cũng chứng minh rằng khi nhuộm với DAFI có thể bảo
quản trong tối đến 24 tuần mà cường độ phát quan không thay đổi. Trong khi
đó AODC cường độ và số lượng phát quang bị giảm khi bảo quản trong vòng 1
tuần ở củng điều kiện.
3.1.3 Đếm bằng kính hiển vi huỳnh quang
Một kỹ thuật khác dựa trên nguyên tắc nhuộm màu đặc hiệu DNA được
gọi là Hoechst 33258 cũng được sử dụng để nhuộm và đếm số lượng vi sinh vật
trên kính hiển vi huỳnh quang. Phương pháp này như sau: Bisbenzumide kết
hợp với vùng DNA giàu adenine và thyamine sau khi gắn phức hợp này sẽ phát
huỳng quang. Hoechst 33258 được sử dụng nhiều trong việc định lượng vi sinh
vật trên bề mặt. Đặt biệt trên bề mặt có gắn các acridine orange. Một sự thuận
lợi khác khi sử dụng phương pháp nhuộm màu bisbenzimide cho phép đếm số
lượng vi sinh vật trong các dụng dịch chất tẩy rửa, trong muối dùng cho các
phòng thí nhiệm hay trong các chế phẩm sinh học khác mà không có sự hiện
diện của DNA. Phương pháp đếm số lượng vi sinh vật bằng phương pháp phát
huỳnh quang được ứng dụng rộng rãi trong việc phân tích các mẫu môi trường
như nước đất ….
Sử dụng dầu nhúng phát quang thấp là một phát minh quan trọng trong
việc hạn chế sự phát huỳnh quang của các màng lọc. Màng carbonate
Nuclepore là một màng cellulose cao cấp dùng trong việc đếm trực tiếp vi
khuẩn bởi vì chúng có kích thước lổ đồng nhất và bề mặt màng phẳng, chúng
có thể giữ lại tất cả các vi sinh vật trên bể mặt của chúng. Màng Nuclepore có
thể nhuộm với thuốc nhuộm Irgalan đen hay các loại thuốc nhuộm phù hợp
khác để tạo nên một nền màu đen tương phản với màu phát quang của vi sinh
vật vì thế việc đếm được thực hiện dễ dàng. Khi sử dụng thuốc nhuộm là
acridine cam vi khuẩn và các vi sinh vật khác phát quang màu xanh hay màu
cam. Màu phát quang xanh hay cam là phụ thuộc vào tình trạng sinh lý của
từng vi sinh vật. Nhưng khả năng phân biệt tế bào đang sống hay tế bào đã chết
bởi mầu phát quang đôi khi đưa đến sự nhầm lẫn. Sử dụng ADPI nhuộm DNA
của tế bào vi khuẩn chúng đưa đến sự phát quang màu xanh dương được cho là
tối ưu hơn so với việc sử dụng acridin cam để nhuộm các vi khuẩn có kích
thước nhỏ.
Số đếm nhận được từ phương pháp đếm trực tiếp trên kính hiển vi phát
huỳnh quang luôn cho kết quả cao tương đương hai lần so với kết quả nhận
được bằng kỹ thuật nuôi cấy khác. Những vi khuẩn có kích thước nhỏ, có hình
dạng bất thường khác cũng đều có thể nhìn thấy bằng phương pháp phát huỳnh
quang. Một số dạng vi sinh vật không thể nuôi cấy trong các môi trường tổng
hợp trong phòng thí nghiệm. Hiện tượng không thể nuôi cấy của các vi sinh vật
cho đến nay vẫn chưa rõ là do chúng thoái hoá, không thể nhân lên trong các
môi trường nhân tạo hay do không đáp ứng được các điều kiện sinh lý cần thiết

cho sự phát triển của chúng. Trong một số trường hợp, sự tương quan cao giữa
phương pháp đếm trực tiếp bằng phương pháp phát huỳnh quang và phương
pháp đếm khuẩn. Tuy nhiên trong một số trường hợp khác sự tương quang này
rất kém. Sự khác biệt giữa phương pháp đếm trực tiếp và phương pháp đếm
khuẫn lạc phản ánh sự chọn lọc của môi trường và điều kiện nuôi cấy, một
phần tế bào bị chết hay bị thương tổn và số loài cụ thể trong mẫu.
Giá trị của số đếm trực tiếp bằng phương pháp phát huỳnh quang trên kính
hiển vi tương đương với với số lượng vi sinh vật thật sự có thể có với tất cả các
loài khác nhau. Điều đó cho phép ước đoán được được số lượng thật sự trong
nước biển, trong nước tự nhiên, trong trong một loại mẫu nào đó, mặt dù các loài
này có sự khác biệt lớn về số lượng của từng chủng loài, khác biệt về đặc điểm
sinh lý diển ra trong cùng điều kiện của mẫu. Số đếm trực tiếp thường phản ánh
đúng với sinh khối, vì thế thường được dùng để ước lượng sinh khối vi sinh vật
có trong mẫu. Tuy nhiên để có được số đếm chính xác bằng kính hiển vi phát
huỳng quang cần phải đếm nhiều lần và nhiều vị trí khác nhau trên mẫu.
Thêm vào đó nếu đếm nhiều tế bào đang phân chia có thể cho phép ước
đoán tốc độ phát triển của vi sinh vật trong mẫu. Tần suất của tế bào đang phân
chia được nhìn thấy có mối liên hệ với chỉ số đo khác của tốc độ phát triển vi
sinh vật như tốc độ tổng hợp RNA được đo bởi sự phòng thích của adenine được
đánh dấu. Tầng xuất của tế bào đang phân chia được tính bằng thời gian giữa lúc
bắt đầu sự thắt của tế bào đến khi tế bào phân chia là một hằng số. Con số này
không phải là bất biến. Thật khó khăn để nhận ra sự phân chia tế bào khi sử dụng
kính hiển vi quang học mà không sử dụng kính hiển vi phát huỳnh quang.
3.2 Các kỹ thuật định lượng vi sinh vật trong mẫu bằng phương pháp
nuôi cấy
Có hai cách để xác định số lượng vi khuẩn bằng phương pháp nuôi cấy:
phương pháp đếm khuẩn lạc và phương pháp ước đoán số lượng vi khuẩn
(MPN – Most probable number). Tất cả các phương pháp định lượng vi khuẩn

trong mẫu bằng phương pháp nuôi cấy đều yêu cầu các tế bào phải được tách
rời nhau, qua quá trình nuôi cấy các tế bào này phát triển thành các dòng riêng
biệt. Tất các qui trình định lượng bằng phương pháp nuôi cấy nhằm chọn lọc
một hay nhiều nhóm vi khuẩn nhất định nào đó, mức độ chọn lọc phụ thuộc và
từng qui trình qui trình cụ thể. Để xác định tổng số vi sinh vật trong mẫu phải
chọn qui trình giảm tối thiểu khả năng chọn lọc. Nhưng dù mức độ chọn lọc ở
mức tối thiểu cũng chỉ định lượng được số lượng vi sinh vật có thể nuôi cấy.
Còn một số lượng lớn vi sinh vật khác không thể phát triển được trong quá
trình nuôi cấy thì không thể định lượng được bằng phương pháp này. Có các
phương pháp định lượng nuôi cấy như sau như sau:
3.2.1 Phương pháp đếm khuẩn lạc
Phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa được sử dụng rộng rãi để định lượng
vi sinh vật, đặc biệt là vi khuẩn, nhưng pháp này có những khuyết điểm và đã
có những cách nhìn nhận khác nhau về mặt khoa học. Khuyết điểm của phương
pháp này nằm trong sự lạm dụng để biểu đạt sai các kết quả. Tất cả mọi người
đều mắc sai lầm khi nhận ra rằng phương pháp này không thể dùng để thu được
kết quả tổng số vi sinh vật.
Phương pháp đếm khuẩn lạc sử dụng nhiều loại môi trường và các điều
kiện nuôi cấy khác nhau. Agar là chất thường được dùng để làm đặc các môi
trường nuôi cấy vì hầu hếr các vi sinh vật đều mất các gen tổng hợp enzym
phân giải agar. Các mẫu đã được pha loãng để trãi lên bề mặt môi trường agar
(phương pháp trãi) hay khuyết tán vào trong nôi trường trước khi làm đặc
(phương pháp đổ đĩa). Một vấn đề cần phải cân nhắc là các vi sinh vật cần xác
định có thể tồn tại và phát triển trong môi trường agar hay không. Một số vi
sinh vật có thể bị chết khi trãi trên bề mặt môi trường trong qui trình cấy trải bề
mặt. Một số loài vi khuẩn khác không thể sống trong điều kiện nhiệt độ duy trì
trạng thái lỏng của agar trong qui trình đổ đĩa. Bởi vì agar chỉ là tác nhân làm
rắn môi trường nuôi cấy trong qui trình định lượng vi sinh vật vì thế trong một
số trường hợp agar có thể được thay thế bằng các tác nhân làm rắn khác. Trong
một số trường hợp các vi sinh vật có các nhu cầu dinh dưỡng đặc biệt khác, các
chất như silicagel có thể được thay thế để làm rắn môi trường. Như ng vì chuẩn
bị môi trường silicagel khó khăn hơn chuẩn bị môi trường agar nên chỉ dùng
môi trường silicagel khi không thể thay thế được môi trường agar.
Phương pháp ống cuộn được dùng để định lượng các vi sinh vật kỵ khí bắt
buộc. Đây là một phương pháp cải biên của phương pháp đổ đĩa. Các đĩa hay
các ống sau khi cấy vi khuẩn được ủ trong điều kiện nhiệt độ đặc biệt trong một
thới gian nhất định để cho sinh vật phát triển thành các khuẩn lạc có thể nhìn
thấy bằng mắt trường, số lượng khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa sẽ được đếm. Số
lượng khuẩn lạc sẽ được gán cho số tế bào đơn lẻ trong mẫu ban đầu. Để số
lượng khuẩn lạc phản ánh được số lượng tế bào vi khuẩn, mẫu phải được phân

tán đều vào trong môi trường hay trên bề mặt môi trtường rắn. Những đĩa có
quá nhiều khuẩn lạc xuất hiện thì không thể cho số lượng đếm chính xác bởi vì
chúng có thể chồng lấp lên nhau. Những đĩa có quá ít khuẩn lạc cũng phải bỏ đi
vì theo nguyên tắc của xác suất.
Những vấn đề chính yếu cần xem xét trong qui trình đếm khuẩn lạc là
thành phần môi trường, điều kiện và thời gian nuôi ủ. Môi trường để định
lượng các vi sinh vật dị dưỡng không thể cố định nitơ phải chứa các nguồn
nitơ, carbon, phosphate dễ sử dụng và các cation, anion cần thiết như sắt,
mangie, calci, natri, clo và sulphate. Thành phần của các hàm lượng không nhất
định, chúng đặt thù cho từng loại môi trường và từng loại mẫu nhất định để có
thể nhận được số lượng vi sinh vật mục tiêu cao nhất. Như vậy môi trường nuôi
cấy phải có các thành phần dinh dưỡng phù hợp với từng yêu cầu của loài vi
sinh vật, bao gồm cả các nhân tố cần thiết khác cho sự phát triển của một hệ vi
sinh vật nhất định. Mục đích chung của môi trường là hàm lượng dinh dưỡng
phải cao hơn các thành phần có trong các mẫu đang phân tích. Hàm lượng dinh
dưỡng trong các loại môi trường đếm tổng số vi sinh vật phải đủ cao, và độc
tính của môi trường đối với sinh vật ở mức thấp nhất.
Để nâng cao hiệu quả của qui trình định lượng vi sinh vật bằng phương
pháp đếm khuẩn lạc, các điều kiện cần phải điều chỉnh sao cho chỉ có các thành
viên vi sinh vật cần phát hiện theo định nghĩa được đếm. Các môi trường đếm
đĩa được chọn lọc hay phân biệt với các thành viên vi sinh vật khác. Qui trình
đếm đĩa chọn lọc được thiết kế cho thích hợp với sự phát triển của vi sinh vật
mong muốn. Sự phát triển của các nhóm vi sinh vật khác được loại bỏ bởi các
thành phần của môi trường hay điều kiện nuôi ủ. Môi trường phân biệt là môi
trường không loại bỏ các nhóm vi sinh vật không mong muốn mà ngược lại cho
phép chúng phát triển cũng trên môi trường đó nhưng có thể biệt phân biệt các
nhóm vi sinh vật mong muốn với các nhóm khác bằng các đặc điểm nhận dạng.
Môi trường cũng có thể được thiết lập để chọn lọc các loài nấm mốc. Mặt
dù kỹ thuật đếm khuẩn lạc không phải là phương pháp được chọn cho việc xác
định số lượng nấm mốc trong các mẫu thực phẩm và trong môi trường. Bởi vì
kỹ thuật này chỉ thích hợp cho việc định lượng các loài vi sinh vật không có sợi
hay bào tử. Dĩ nhiên phương pháp đếm khuẩn lạc cũng thích hợp cho việc định
lựơng các loài nấm men. Vì số lượng của vi khuẩn luôn nhiều hơn số lượng của
nấm mốc nên để ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn trong các khuẩn lạc của
nấm mốc, các tác nhân ức chế vi khuẩn được thêm vào trong các môi trường
nuôi cấy. Các thuốc nhuộm bengal rose và các kháng sinh như streptomycine,
neomycine thường được sử dụng là những tác nhân ức chế vi khuẩn. Một biện
pháp đơn giản để ức chế sự phát triển của vi khuẩn là hạ thấp pH của môi
trường nuôi cấy xuống khoảng 4,5 - 5,5. Hầu hết các nấm mốc đều không bị tác
động khi phát triển trong khoảng pH này nhưng khi đó vi khuẩn bị ức chế.

Môi trường chọn được xác lập công thức để ức chế sự phát triển của nhóm
vi sinh vật và cho phép một nhóm vi sinh vật khác phát triển. Ví dụ môi trường
Saubouraud Dextrose Agar được dùng để định lượng nấm mốc dựa trên nguyên
tắc pH thấp và nguồn carbohydrate. Bổ sung vào môi trường các chất kháng
sinh khác như peniciline hay methyl bule là những tác nhân ức chế vi khuần
gram âm. Các vi sinh vật kháng kháng sinh cũng có thể được định lượng trên
môi trường bằng cách thêm vào đó một liều lượng kháng sinh.
Môi trường phân biệt được thiết lập dựa trên nhiều cách. Các thuốc thử
được thêm vào trong môi trường để cho phép nhận ra các sự khác biệt của
những vi sinh vật mong muốn. Có thể thêm thuốc thử vào môi trường sau khi
nuôi cấy để nhận ra các loài vi sinh vật đặc trưng cần tìm. Chìa khoá nâng cao
khả năng phân biệt của môi trường là qui trình nuôi cấy để cho phép môi
trường phân biệt một cách tốt nhất với vi sinh vật cần định lượng và các vi sinh
vật khác có trong mẫu.
Môi trường Eosin methyl blue (EMB) và MacConkey agar là những môi
trường được sử dụng rộng rãi trong việc phân tích vi sinh vật trong nước.
Những môi trường này bao gồm tính chọn lọc và tính phân biệt. Chúng chọn
lọc cho sự phát triển của các vi khuẩn gram âm bởi trong đó có thêm vào các
tác nhân ức chế các vi khuẩn gram dương. Môi trường này có thể phân biệt các
vi khuẩn có thể sử dụng lactose bởi sự hình thành các khuẩn lạc có thể phân
biệt bằng màu sắc. Trên môi trường EMB, vi khuẩn thuộc nhóm coliforms là
nhóm gram âm tạo nên những khuẩn lạc có màu tím ánh kim. Định lượng số
lượng coliform bằng cách đếm số lượng khuẩn lạc có các đặc điểm này. Cách
này thường xuyên được sữ dụng trong việc phân biệt các vi sinh vật chỉ thị
trong nước và trong thực phẩm.
Với kỹ thuật đến khuẫn lạc, các mẫu cần phân tích phải được pha loãng
thành chuỗi pha loãng liên tiếp và được xác định một vài nồng độ pha loãng
nhất định để cấy vào các môi trường đã chọn phù hợp với các đối tượng cần
xác định. Mổi khuẫn lạc được hình thành được gán cho một đơn vị hình thành
khuẩn lạc (cfu-colony forming units). Kỹ thuật thường qua các bước như sau:
Dung dịch pha loãng: một số dung dịch dùng để pha loãng có thể làm chết
tế bào như: nước muối, nước cất. Các dung dịch pha loãng không được dùng
ngay khi lấy ra từ tủ lạnh có thể gây sốc và làm cho vi sinh vật không thể phát
triển được. Dung dịch pepton water là dung địch pha loãng được sử dụng nhiều
nhất và được xem là dung dịch pha loãng cho tất cả các loại mẫu. Nếu trong
mẫu còn có một ít các chất khử trùng thì phải thêm vào dung dịch pha loãng tác
nhân giảm thiểu khả năng khử trùng của chúng, ví dụ: nếu trong mẫu còn dư
lượng của các hợp chất amonium (NH4-) thì có thể thêm vào đó Tween 80 hay
lecithin. Ngược lại nếu trong mẫu có chứa các hợp chất chlorin hay iodin thì
cần thêm vào đó các muối như sodium thiosulphate.

Chuẩn bị các chuỗi pha loãng mẫu
Bơm chính xác 9ml dung dịch pha loãng vào trong ống nghiệm có nắp
đậy. Nếu sử dụng các ống nghiệm có nắp không đóng chặc được thì phải khử
trùng ống nghiệm, sau đó bơm dung dịch pha loãng vào, các thao tác này phải
được thực hiện một cách vô trùng. Phân phối dung dịch pha loãng vào các ống
sau khi khử trùng còn có ý nghĩa đảm bảo thể tích dung dịch pha loãng không
bị mất do quá trình khử trùng. Các thao tác pha loãng tuỳ thuộc vào từng loại
mẫu. Cụ thể như sau:
- Nếu pha loãng các mẫu là chất lỏng, trước khi pha loãng mẫu phải được
lắc kỹ, cắm đầu pippette sâu vào trong mẫu khoảng 1” hút ra 1ml, cho vào
trong ống chứa dung dịch pha loãng đầu tiên, lắc kỹ ống nghiệm chứa mẫu, bỏ
pippette vừa sử dụng, dùng một pipptte mới thực hiện lại thao tác như trên với
các độ pha loãng tiếp theo. Cứ tiếp tục như vậy cho đến khi đạt được độ pha
loãng mong muốn. Mỗi độ pha loãng chỉ được phép sử dụng 1 pippette. Hàm
lượng mẫu trong 1ml dung dịch các độ pha loãng của dãy như sau:
Ống số 1 2 3 4
Tỉ lệ pha
loãng
1/10 1/100 1/1000 1/10000
Thể tích mẫu
ban đầu (ml)
0,1 0,01 0,001 0,0001
Độ pha loãng 10-1
10-2
10-3
10-4
- Đối với các mẫu rắn hay bán lỏng, các thao tác được tiến hành như sau:
cân 10 g mẫu vào trong các bao dập mẫu hay các máy xay vô trùng, thêm 90ml

dung dịch pha loãng và đồng nhất mẫu, phải đảm bảo sao cho vi khuẩn phân
tán đều vào trong dung dịch. Sau khi mẫu và dung dịch pha loãng được đồng
nhất ta được dung dịch pha loãng 1/10. Các độ pha loãng sau được tiến hành
tương tự như phần pha loãng mẫu lỏng. Trong 1ml các dung dịch pha loãng
chứa hàm lượng mẫu như sau:
Ống số 1 2 3 4
Tỉ lệ pha
loãng
1/10 1/100 1/1000 1/10000
Thể tích mẫu
ban đầu (g)
0,1 0,01 0,001 0,0001
Độ pha loãng 10-1
10-2
10-3
10-4
Cấy mẫu bằng phương pháp đổ đĩa
Các môi trường agar được đun chảy trong các chai hay trong các ống
nghiệm có thể tích phù hợp. Được làm mát trong các bể điều nhiệt ở 45o
C.
Hút 1ml mỗi dung dịch pha loãng cho vào trong đĩa petri vô trùng. Mỗi độ
pha loãng thường được cấy vào hai đĩa petri hay nhiều hơn. Cũng sữ dụng các
pippette sạch cho mỗi độ pha loãng. Chỉ chọn cấy vào đĩa petri những độ pha
loãng có mật độ vi sinh vật phù hợp, thường trong khoảng 25-300 tế bào/ml.
Đỗ vào mỗi đĩa đã cấy 10-15ml môi trường đã được đun chảy và làm nguội, lắc
đĩa theo chiều và ngược chiều kim đồng hồ khoảng 5-6 lần, đặc đĩa lên mặt
phẳng ngang và đợi cho đến khi môi trường trong đĩa đông đặc. Lật ngược đĩa
và ủ trong điều kiện nhiệt độ và thời gian xác định.
Cấy mẫu trên bề mặt
Đây là phương pháp thay thế cho phương pháp đổ đĩa để phân tích các chỉ
tiêu vi sinh trong thực phẩm, nhất là các chỉ tiêu vi sinh vật nhạy cảm với nhiệt độ
như Pseudomonas, các vi sinh vật này sẽ bị suy yếu khi tiếp xúc với nhiệt độ của
môi trường agar ở trạng thái lỏng. Phương pháp này cũng được dùng để phân tích
các chỉ tiêu mà các dòng nhận được phải cấy chuyền ở các bước tiếp theo.
Cấy 0,1ml hay thể tích phù hợp lên bề mặt bằng pipettes hay bằng que cấy
lên đĩa môi trường đã được làm khô và trải đều bằng que cấy trang hay que cấy
vòng để trãi mẫu trên khắp bề mặt môi trường. U các đĩa đã cấy ở điều kiện
nhiệt độ và thời gian xác định tuỳ theo từng chỉ tiêu phân tích, đếm các khuẩn
lạc đặc trưng hay tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa.
Khi đếm các khuẩn lạc, trong một số trường hợp xuất hiện các khuẩn lạc
mọc lan, thông thường các khuẩn lạc khác cũng được nhìn thấy bên trong các
vết khuẩn lạc loang. Khi đếm ta chỉ coi khuẩn lạc loang là một đơn vị hình

thành khuẩn lạc và đến các khuẩn lạc khác trong khuẩn lạc loang. Các khuẩn
lạc loang này là do các vi khuẩn tập trung thành từng tập đoàn trong quá trình
phát triển.
Đếm khuẩn lạc trong trường hợp cấy trang hay đổ đĩa
Đếm tất cả các khuẫn lạc đơn lẻ trên các đĩa cấy đã chọn, thông thường
chọn các đĩa có số lượng khuẩn lạc trong khoảng 30 - 300 khuẩn lạc. Thường
dùng các bút có thể viết lên thuỷ tinh để đánh dấu các khuẩn lạc đã đếm phía
sau đĩa petri. Có thể dùng các thiết bị hổ trợ trong quá trình đếm số lượng
khuẩn lạc như máy đếm hay kính lúp. Tính toán số đơn vị hính thành khuẩn lạc
theo các công thức thống kê dựa trên thể tích mẫu cấy, số lượng khuẩn lạc trên
các đĩa, độ pha loãng đã cấy và số lượng đĩa của mỗi độ pha loãng. Thông
thường số đơn vị hình thành khuẩn lạc trong một gram mầu hay 1ml được tính
toán ít nhất từ hai nộng độ pha loãng liên tiếp của mẫu. Các tường trình kết quả
được biểu diễn dưới dạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc/g (ml) (cfu/g). Không
biểu diễn kết quả dưới dạng số vi khuẩn/g(ml).
Phương pháp đểm khuẩn lạc trên ống
Thay vì dùng đĩa petri, có thể dùng ống nghiệm có đường kính lớn hay các
chai nhỏ có nắp để thay thế. Cấy mẫu vào, cho môi trường vào, lắc theo chiều
ngang cho đến khi môi trường trong chai hay ống đống đặc.
Phân phối 2-4 ml môi trường có hàm lượng agar cao hơn các môi trường
dùng cho đổ đĩa khoảng 0,5-1% vào ống nghiệm có nắp với thể tích 25ml, môi
trường đã được làm nguội đến 45o
C, cấy vào ống nghiệm 0,1ml mẫu đã được
pha loãng. Lắc các ống theo chiều ngang trong nước lạnh cho đến khi agar
động đặc tạo thành một màng film đồng nhất trên thành ống nghiệm. Vì thế kỹ
thuật này cần có những kỹ năng khéo léo. Một phương pháp khác có thể được
dùng là sử dụng một mẫu nước đá, đặt lên trên một mảnh vải và làm một đường
rảnh bằng với ống nghiệm bằng các xoay tròn ống nghiệm đặt ngang trên
miếng băng. Các ống nghiệm đã cấy mẫu và môi trường được xoay trên mảnh
Máy đếm khuẩn lạc Máy đếm khuẩn lạc
tự động

của miếng băng. Với phương pháp này, các người thực hiện có thể tiết nhiện
được nhiều thới gian và sức lao động.
Các ống sau khi cấy mẫu được lật ngược để tránh sự ngưng tụ hới nước
gây nên vết loang sau khi ủ. Đếm các khuẩn lạc xuất hiện trong lớp màng fiml
agar xung quanh ống, các khuẩn lạc nằng sâu bên trong có thể được quan sát
bằng kính lúp.
Phương pháp dùng kỹ thuật ống xoay được sử dụng nhiều trong việc phân
tích các mẫu sữa và các sản phẩm của sữa, các loại mẫu thực phẩm công
nghiệp. Cho đến nay đã có những thiết bị thay thể cho việc xoay ống, đảm bảo
các màng film trên thành ống đồng nhất và tiết kiệm được thời gian cũng như
công lao động.
Phương pháp cấy theo đường xoắn ốc
Phương pháp này dựa trên sự hổ trợ của một thiết bị xoay. Thiết bị này có
thể hoật động hoàn toàn tự động và cũng có thể hoạt động không tự động. Thiết
bị này sẽ phân phối một lượng mẫu xác định lên bề mặt đĩa đang xoay tròn.
Điểm tiếp xúc của mẫu và đĩa môi trường bắt đầu từ trung tâm đĩa và di chuyển
dần ra bên ngoài theo đường xoắn ốc. Sau khi làm khô bề mặt môi trường, đĩa
được ủ trong điều kiện xác định, vi khuẩn sẽ phát triển theo đường xoắn ốc.
Càng xa tâm của đĩa, mật độ vi sinh vật sẻ giảm dần và sẽ xuất hiện các khuẩn
lạc riêng biệt.
Căn cứ vào tốc độ xoay của thiết bị, thể tích mẫu phân phối và kích thước
của đĩa, mật độ khuẩn lạc xuất hiện ở vòng xoắn cuối cùng sẽ tính được mật độ
vi sinh vật trong mẫu. Kết quả tổng số đơn vị hình thành khuẩn lạc được xác
định bằng phương pháp này được cho là tương đương với phương pháp đổ đĩa
hay cấy trải trên bể mặt. Các hệ thống tự động được thiết kế dựa trên nguyên
tắc cấy xoay được thiết kế với sự hỗ trợ của các máy đếm khuẩn lạc bắn tia
laser đã được bán ngoài thị trường rất thuận tiện cho việc phân tích tổng số vi
sinh vật và cho kết quả chính xác trong thới gian nuôi cấy ngắn.
Phương pháp đếm khuẩn lạc trên màng lọc
Phương pháp này thường được áp dụng cho các mẫu lỏng như nước,
sữa… và được đánh giá là cho kết quả chính xác hơn so với phương pháp ứơc
đoán MPN. Các mẫu chất lỏng được lọc qua màng lọc có kích thước lổ lọc nhỏ
hơn kích thước của vi sinh vật. Vi sinh vật được giữa lại trên màng lọc. Màng
được đặt trên môi trường agar hay trên giấy thấm được ngấm sủn môi trường
nuôi cấy lỏng đã chọn và ủ trong điều kiện xác định. Sau khi ủ, đếm các khuẩn
lạc sẽ xuất hiện trên bề mặt màng lọc.
Thiết bi lọc có thể bằng thủy tinh, bằng kim loại hay bằng nhựa, bao gồm
phễu lọc giá đở màng lọc, bộ thiết bị hổ trợ hút chân không và bình chứa. Màng
lọc được làm bằng cellulose ester có lỗ lọc mằm trong khoảng 0,1-1 µm, các

loại màng lọc dùng cho việc phân tích tổng số vi sinh vật thường có kích thước
lổ lọc là 0,47µm, đường kính màng lọc có nhiều kích cở khác nhau phù hợp với
đường kính của phễu lọc, bề dày của màng khoảng 120µm. Khi lọc tất cả các vi
khuẩn đều được giữ lại trên màng. Khi đặc màng lọc sao cho bề trên của màng
hướng lên phía trên, vi khuẩn không tiếp xúc trực tiếp với môi trường nhưng,
các thành phần của môi trường dễ dàng thấm qua màng và nuôi vi khuẩn phát
triển thành khuẩn lạc. Một số loại màng lọc có gắn các lưới kỵ nước chỉ cho
phép khuẩn lạc phát triển trong mỗi ô của lưới và không cho lan sang các ô
khác nhằm tạo điều kiện thuận tiện khi đếm.
Các bộ phận của thiết bị lọc

3.2.2 Phương pháp ước đoán số lượng vi sinh bằng kỹ thuật MPN
(Most Probable Number):
Phương pháp MPN là phương pháp có thể thay thế phương pháp đếm
khuẩn lạc để xác định mật độ vi sinh vật trong mẫu, phương pháp này được dựa
trên nguyên tắc xác suất thống kê sự phân phân bố vi sinh vật trong các độ pha
loãng khác nhau của mẫu. Mỗi độ pha loãng được nuôi cấy lặp lại nhiều lần
trong các môi trường lỏng đã được chọn, thông thường phải cấy lặp lại từ 3-10
lần tại mỗi nồng độ pha loãng. Các độ pha loãng được tiến hành sao cho trong
các lần lặp lại có một số lần cho dầu hiệu dương tính và một số lần cho dấu
hiệu âm tính. Số lần lặp lại cho dấu hiệu dương tính và âm tính được ghi nhận
để đối chiếu với bảng thống kê sẽ được giá trị ước đoán số lượng vi sinh vật
trong mẫu. Qui trình MPN cho giá trị số lượng vi sinh vật trong mẫu có ý nghĩa
thống kê theo xác suất phân bố vi sinh vật trong mẫu khi sử dụng một số lần lặp
lại, vì thế khoảng tin cậy là rất lớn. Phương pháp MPN để định lượng vi sinh
vật cho đến nay đã có nhiều cải tiến cho phép tiến hành qui trình dễ dàng và tốn
ít sức lao động hơn và cho giá trị chính xác cao hơn.
Chọn nồng độ pha loãng sao cho trong các lần lặp lại có một số lần cho
kết quả dương tính và một số lần cho kết quả âm tính , sự lựa chọn này rất quan
trọng. Trong nhiều trường hợp qui trình MPN được thiết lập sao cho gia tăng số
lượng lần lặp cho kết quả dương tính bằng tín hiệu phát triển của vi sinh vật.
Trong một số trường hợp khác, qui trình được thiết lập có nhiều thử nghiệm
khẳng định sau khi các lần lặp lại ở các độ pha loãng cho tín hiệu phát triển của
vi sinh vật như phát hiện protein hay một emzym nào đó. Các thử nghiệm sau
này cho kết quả dương tính thì các lần lặp lại ban đầu mới được khẳng định là
dương tính. Cũng giống như qui trình đếm khuẩn lạc, qui trình MPN cũng được
sử dụng các môi trường chọn lọc, không chọn lọc hay môi trường phân biệt.
Phương pháp MPN cũng được dùng để định lượng virus đường ruột.
Trong phương pháp này, một chuỗi pha loãng của mẫu cần kiểm tra được cho
vào trong các ống nghiệm chứa tế bào chủ thích hợp được nuôi cấy. Sau khi ủ,
các ống nghiệm được kiểm tra hiệu ứng cytopathic (CPE), đó là các biểu hiện
làm chết tế bào bị xâm nhiễm. Số lượng virus trong mẫu cũng nhận được từ
bảng MPN bằng sự tham chiếu số lượng các ông nuôi cấy cho hiệu ứng CPE
dương tính. Số lượng của virus cũng có thể được định lượng bằng chỉ số TCID
50 (Tissue culture infectious dose 50%). Nồng độ pha loãng thấp nhất có sự
hiện diện của virus đó là nộng độ có tỉ số CPE là 50% trong các ống nghiệm.
Cũng giống như qui trình đếm đĩa, trong phương pháp MPN, môi trường
và nồng độ nuôi cấy cũng được điều chỉnh để chọn lọc cho một nhóm vi sinh
vật hay phân biệt các nhóm vi sinh vật này với các nhóm vi sinh vật khác với
các đặc điểm mong muốn, rỏ ràng rằng sự kết hợp giữa điều kiện nuôi cấy và
môi trường cũng có thể định lượng những nhóm vi sinh vật đặc biệt nào đó

theo định nghĩa cụ thể. Mỗi qui trình phải được chọn lọc một cách cụ thể và
cẩn thận để có thể thu được kết quả một cách chính xác.
Theo quan điểm của C.H. Collins và Patricia M. Lyne thực chất con số
MPN biểu diển số lượng vi sinh vật trong mẫu là số lượng trung bình sau các
lần lặp lại. Nếu số lượng vi sinh vật trong mẫu lớn thì sự khác biệt của các mẫu
giữa các lần lặp lại là nhỏ, kết quả riêng lẻ của tất cả các lần lặp gần với kết quả
trung bình. Nều số lượng vi sinh vật trong mẫu nhỏ, sự khác biệt này sẽ lớn.
Nều trong một mẫu chất lỏng chứa 100 vi sinh vật/100 ml, thì trong 10 ml mẫu
sẽ chứa trung bình 10 tế bào. Dĩ nhiên có một số phần mẫu nhiều hơn 10 tế
bào, thậm chí có những phần mẫu có thể chứa 20 tế bào trong 10ml mẫu và một
số phần mẫu chứa ít hơn. Nếu tất cả các phần mẫu trên được nuôi cấy trong
môi trường và điều kiện thích hợp, các vi sinh vật trong mẫu sẽ phát triển và
cho tín hiệu dương tính.
Tương tự như vậy, 1ml sẽ chứa trung bình 1 tế bào vi sinh vật, như vậy có
những lần lấy sẽ có 2 hay 3 tế bào và có những lần lấy sẽ không có tế bào nào.
Nếu các lần hút này được nuôi cấy trong môi trường và điều kiện thích hợp sẽ
thu được những ống nghiệm cho kết quả dương tính và những ống cho kết quả
âm tính.
Nếu hút 0,1ml thì sau 10 lần hút mới có khả năng nhận được 1 lần hút có
1 tế bào, như vậy hầu hết các lần nuôi cấy khi lấy 0,1ml thì đều cho kết quả
âm tính.
Có thể tính toán con số chắc chắn số lượng vi sinh vật trong trong 100ml
mẫu bằng sự kết hợp các kết quả nhận được từ các chuỗi cấy như trên. Bảng giá
trị MPN khi sử dụng hệ thống cấy với các dãy 5 ống 10ml, 5 ống 1ml và 5 ống
0.1ml đã được tính sẵn và dùng cho phân tích các mẫu nước hay các mẫu đã
pha loãng. Cho đến nay có rất nhiều bảng giá trị MPN được sử dụng với độ
chính xác và các khoảng tin cậy khác nhau và được sử dụng cho các mục đích
khác nhau.
Phương pháp MPN được dùng chủ yếu để phân tích Coliforms và các vi
sinh vật khác khi chúng phát triển trong môi trường nuôi cấy lỏng cho các tín
hiệu dễ dàng nhận dạng như sinh hơi, làm đục môi trường chọn lọc, thay đổi
pH môi trường … Ví dụ nấm men và nấm mốc trong nước trái cây hay rau quả,
vi sinh vật kỵ khí hay các bào tử Clostridia.
3.2.3 Phương pháp lai khuẩn lạc
Lai khuẩn lạc là phương pháp kết hợp giữa phương pháp lai phân tử và
phương pháp nuôi cấy truyền thống trong việc phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật
trong các mẫu. Sau thời gian nuôi cấy trên bề mặt môi trường thạch, các khuẩn
lạc vi khuẩn được chuyển lên màng lai, các khuẩn lạc này được ly giải trong
môi trường kiềm hay xử lý bằng emzym, sau đó tiến hành lai phân tử. Phương

pháp này phụ thuộc vào khả năng phát triển của vi sinh vật mục tiêu trên môi
trường, chúng không phụ thuộc sự phát triển các các quần thể vi sinh vật khác.
Sự phát triển của vi sinh vật mục tiêu trong môi trường làm gia tăng số lượng
bản sao của các gen mục tiêu, vì thế chúng sẽ gia tăng khả năng phát hiện của
các mẫu dò.
Nguyên tắc của phương pháp này được phát triển đầu tiên bởi M.
Grunstein và S.D. Hogness (1975) nhằm mục đích sàng lọc trên đĩa có mật độ
cao cho các dòng nuôi cấy thuần. Trong qui trình nuôi cấy khuẩn lạc vi khuẩn
phát triển trên môi trường rắn được chuyển lên một giá đở phù hợp như màng
nitrocellulose, ly giải để tách DNA và biến tính chúng sau đó cố định chúng
trên màng. Màng lọc cố định DNA được ủ với mẫu dò. Mẫu dò được tách ra từ
một đoạn thông tin di truyền. Và được đánh dấu bằng các các đống vị phóng xạ
như 32P hay các chất phát quang khác như biotin. Hiện tượng lai được din ra
nếu các trình tự base của các tế bào được ly giải tương đồng với các trình tự
trên mẫu dò để hình thành các đoạn lai mạch đôi. Các đoạn lai này được phát
hiện bằng bằng các film phóng xạ tự ghi khi các mẫu dò được đánh dầu bằng
các đồng vị phóng xạ, hay các film nhạy sáng khi các mẫu dò được đánh dấu
bằng biotin. Bằng phương pháp này, các đặc điểm di truyền đặc trưng được
phát hiện một cách chuyên biệt. Nếu chọn mẫu dò đặc trưng cho một nhóm vi
sinh vật, phương pháp này có thể phát hiện và định lượng nhóm vi sinh vật đó
trong mẫu.
Mẫu dò được lai với các vi sinh vật có nguồn gốc từ mẫu, hay các dòng
thuần được phân lập và nuôi cấy thứ cấp. Bằng phương pháp này có thể cải
thiện được các bất tiện trong quá trình phân tích bằng phương pháp nuôi cấy
thuần tuý như:
- Tránh được những sai lệch trong quá trình đếm khuẩn lạc trên môi
trường nuôi cấy chọn lọc.
- Chắc chắn phát hiện được các dòng mang kiểu gen mục tiêu cần phát hiện
dù các gen đó không hay biểu hiện rất kém trong một số điều kiện nuôi cấy.
- Có thể phân tích được các vi sinh vật bị tress hay không thể nuôi cấy
được trên các môi trường chọn lọc bằng cách thay thế bằng môi trường không
chọn lọc hay môi trường dinh dưỡng tối đa.
- Giảm được thời gian phân tích bằng cách giảm thời gian nuôi cấy, quá
trình định lượng giả định và thời gian khằng định kiểu gen hay kiểu hình.
Phương pháp lai khuẩn lạc cũng được sử dụng để khẳng định các dòng vi
sinh vật nghi ngờ đã được làm thuần.
Ứng dụng chủ yêu của phương pháp lai khuẩn lạc là phát hiện, định lượng
và phân lập các vi sinh vật có kiểu hình và kiểu gen đặc trưng. Và được sử dụng
đặc biệt trong việc kiểm soát sự hiện diện và hoạt động của các dòng vi sinh vật

trong môi trường. Nghiên cứu sự phân bố các vi sinh vật kháng kháng sinh,
kháng kim loại nặng trong nước trong các mẫu môi trường và trong thực phẩm.
3.3 Phương pháp đo độ đục
Là phương pháp gián tiếp xác định mật độ vi sinh vật. Định lượng mật độ
tế bào thông qua đo độ đục bằng máy so màu ở các bước sóng từ 550 – 610 nm.
Phương pháp xác định mật độ tế bào theo độ đục có thể được dùng để so
sánh mức độ tăng trưởng của hai hay nhiều chủng vi sinh vật trong môi trường
lỏng. phương pháp này cho kết quả nhanh chóng và thường được ứng dụng
trong theo dõi hoặc nghiên cứu đặc trưng tăng trưởng của các chủng vi sinh vật
trong phòng thí nghiệm hoặc trong sản xuất tuy nhiên không thích hợp dùng
trong kiểm nghiệm vi sinh vật.
N
A (CFU/g hay CFU/ml) = Trong đó:
n1Vf1 + …+ niVfi
A: số tế bào vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu
N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn
ni: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i
V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa
fi: độ pha loãng tương ứng

IV. ÁP DỤNG ĐỐI VỚI MỘT SỐ VI SINH VẬT
GÂY BỆNH TRONG THỰC PHẨM
4.1 Định lượng Fecal Coliform và E. Coli bằng phương pháp đếm đĩa
Coliforms chịu nhiệt: là những vi khuẩn sinh trưởng cho khuẩn lạc điển
hình trên môi trường thạch Violet Red Bile ở 440
C trong 24 giờ. Trong trường
hợp nghi ngờ, vi khuẩn được khẳng định bởi sự tạo khí trong môi trường EC
broth ở 44 0
C trong 24 giờ.
E. coli: là Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh indol ở 44 0
C.
Nguyên tắc:
Cấy một lượng mẫu đã biết trên môi trường rắn không chọn lọc. Sau đó , ủ
sơ bộ ở nhiệt độ phòng (20-250
C) trong 1-2 giờ, phủ lên một lớp môi trường
rắn chọn lọc có chứa Lactose. Các đĩa được ủ ở 440
C trong 24h, sau đó đếm
những khuẩn lạc điển hình và nghi ngờ cấy những khuẩn lạc đã chọn lên những
môi trường khẳng định thích hợp.
Môi trường-thuốc thử -dịch pha loãng:
- Dung dịch Saline Peptone
- Thạch Tryptone Soya ( TSA )
- Thạch Violet Red Bile ( VRB )
- Canh Escherichia coli (EC broth)
- Canh Tryptone
- Thuốc thử Kovac’s
Chủng chứng:
- Chủng chứng dương: Escherichia coli
- Chủng chứng âm: Salmonella typhimurium
Thiết bị chính:
- Tủ ấm 44.0 + 0.50
C
Quy trình:
Chuẩn bị mẫu.
Đổ đĩa: Cấy 1ml mẫu ở nồng độ thích hợp vào đĩa Petri . Thêm vào 5ml
môi trường TSA đã được làm nguội ở 45.00+1.00C. Trộn đều dịch nuôi cấy và
môi trường. Ủ sơ bộ các đĩa ở nhiệt độ phòng (20 - 25 0C) trong 1-2 giờ. Đổ
thêm 10-15ml VRB agar đã được làm nguội ở 45.00 +1.00C . Tỷ lệ môi trường
giữa hai lần đổ ít nhất là 1:2.
Nuôi ủ: Các đĩa được lật ngược lên và ủ ở 44.0 + 0.50C trong 24 ±3 h.

Đọc kết quả: Chọn các đĩa có số khuẩn lạc điển hình và không quá 100 để
đếm. Khuẩn lạc coliform chịu nhiệt điển hình có màu đỏ sậm, đường kính ít
nhất là 0,5mm, xung quanh khuẩn lạc có vùng kết tủa đỏ.
Khẳng định:
Coliform chịu nhiệt : Chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ của mỗi loại, cấy vào
môi trường canh EC, ủ ở 44.0 + 0.50
C trong 24±3 h. Phản ứng được xem là
dương tính khi trong ống Durham có khí.
E. coli:Test dương tính của Coliform chịu nhiệt được thực hiện thêm về
khả năng tạo indol trong môi trường canh tryptone bằng cách thêm 0.3- 0.5 ml
thuốc thử Kovac's trực tiếp vào trong môi trường Tryptone đã được ủ ở 44.0 +
0.5 0
C trong 24±3 h. Phản ứng được xem dương tính khi có màu đỏ xuất hiện
trên bề mặt. Màu vàng hay màu cam xuất hiện trong 10 phút được xem là âm
tính. E.coli giả định cho phản ứng indol dương tính.
Báo cáo kết quả: Đếm kết quả bằng cách nhân số khuẩn lạc đã đếm với
nồng độ pha loãng và tỷ lệ khẳng định dương tính.
Các chú ý và giới hạn của phương pháp
Thuốc thử Kovacs’ là mối nguy cho sức khỏe, vì vậy cần sử dụng các biện
pháp chống độc như đeo khẩu trang và pha thuốc thử trong tủ hốt.
Không được thanh trùng môi trường VRB và đun quá nhiệt.
Rót môi trường E.C vào các ống nghiệm có ống Durrham đảo ngược. Các
ống này sẽ chìm xuống sau khi hấp thanh trùng.
Tỷ lệ độ dày giữa lớp trên và lớp dưới của môi trường VRB nên là 2:1.
4.2 Định lượng Vibrio Parahaemolyticus
Nguyên tắc: Cấy lượng mẫu đã biết vào môi trường thạch chọn lọc
(TCBS). Những khuẩn lạc V.parahaemolyticus điển hình sẽ được thử nghiệm
sinh hoá.
Môi trường và thuốc thử:
- Thạch TCBS (Thiosulphate citrate bile salt sucrose); Thạch Motility
medium; Thạch OF
- Canh tryptone có nồng độ NaCl 0%, 6%, 8%, 7%
- Đĩa ONPG
- Đĩa O/129 Vibriostaticum chứa 150μg 2,4- diamino- 6,7-
diisopropylpteridine
- Canh Lysine decacboxylase
- Dung dịch các loại đường sucrose, lactose, cellobiose
- Canh Ure
- Thuốc thử N,N,N’,N’-tetramethyl-1,4 phenylenediamine (TMPD)

Thiết bị chính: Tủ ấm 37,0 ± 1,0 0
C
Quy trình:
Chuẩn bị mẫu.
Cấy mẫu: Cấy trang 1 ml dịch mẫu ở nồng độ thích hợp bằng que cấy tam
giác lên 03 đĩa môi trường thạch TCBS.
Nuôi ủ: Ủ các đĩa ở 37,0 ± 1,00
C trong 2 ngày, đọc kết quả sau 1 và 2 ngày.
Đọc kết quả:Trên môi trường thạch TCBS khuẩn lạc V. parahaemolyticus
tròn, có màu xanh, đường kính 3 – 5mm.
Thử nghiệm sinh hoá: Từ các khuẩn lạc nghi ngờ trên TCBS cấy chuyển
sang môi trường TSA có bổ sung thêm 1% NaCl, ủ ở 37,0 ± 1,0 0
C / 1 ngày.
Thử nghiệm sơ bộ:
Thử nghiệm sinh hoá Kết quả
Di động +
OF lên men, sinh khí
Oxidase +
KOH +
Ghi chú: A: Axit, K: Kiềm.
Test khẳng định:
Thử nghiệm sinh hoá Kết quả
Phát triển ở các nồng độ
muối:
0%NaCl -
6%NaCl +
8%NaCl +
10%NaCl -
Sinh acid từ:
Succrose |%NaCl -
Mannitol +
Cellobiose -
ONPG -
ADH -
LDC +
Ure -
O/129 10 μg R(không nhạy)
O/129 150 μg S(nhạy)

4.3 Định lượng Coliforms, Coliforms chịu nhiệt, E. Coli giả định
(Fecal Coliforms) bằng phương pháp MPN
Trong phương pháp này:
Coliforms là những vi sinh vật sinh hơi trong môi trường canh Lauryl
sulphate và canh Brilliant green lactose bile salt nuôi ủ ở 37.0o
C ± 1.00
C/ 2 ngày.
Coliforms chịu nhiệt là những vi sinh vật sinh hơi trong môi trường canh
EC nuôi ủ ở 44.5o
C ± 0.2 0
C/1 ngày.
E. coli giả định (Coliforms phân) là Coliforms chịu nhiệt sinh indole trong
canh trypton nuôi ủ ở 44.5o
C ± 0.2 0
C/ 1 ngày
Nguyên tắc:
Số lượng Coliforms, Coliforms chịu nhiệt, E.coli giả định (Coliforms
phân) và E.coli được xác định bằng phương pháp MPN, phương pháp này dựa
vào nguyên tắc mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân (hai nồng độ kế
tiếp chênh nhau 10 lần) và đưa vào các ống nghiệm có chứa môi trường thích
hợp, ủ và đọc số ống cho kết quả dương tính. Số ống nghiệm cho phản ứng
dương tính của các nồng độ pha loãng được tra theo bảng MPN để xác định
tổng số vi khuẩn trong 1 g (hoặc 1 ml) mẫu.
Môi trường và thuốc thử:
- Canh Lauryl sulphate (Sodium dodecyl sulphate - LSB)
- Canh Brilliant green lactose bile salt (BGBL)
- Canh EC (E.coli medium)
- Canh Tryptone
- Thuốc thử Kovac’s
Thiết bị:
- Bể điều nhiệt 44.5o
C ± 0.2 0
C
- Tủ ấm 37.0o
C + 1.00
C
Tiến hành:
- Coliforms:
Cấy 1 ml dịch mẫu đã pha loãng 1:9 vào dãy 5 ống nghiệm, mỗi ống chứa
10 ml canh Lauryl sulphate. Thực hiện tương tự với dịch mẫu đã pha loãng
1:10 và 1:100. Nếu nghi ngờ lượng vi sinh vật trong mẫu quá cao, phải tăng độ
pha loãng mẫu. Ủ ở 37.0o
C + 1.00
C/2 ngày. Ghi nhận số ống có sinh hơi sau ủ 1
ngày và 2 ngày.
Dùng khuyên cấy cấy chuyển dịch mẫu từ các ống LSB dương tính (ống
sinh hơi) sang các ống có chứa canh Brilliant green lactose bile salt. Ủ ở 37.0o
C
± 1.00
C/2 ngày. Đọc số lượng các ống cho kết quả dương tính(ống sinh hơi). Số
ống nghiệm cho phản ứng dương tính của các nồng độ pha loãng được tra theo
bảng MPN để xác định tổng số Coliforms trong 1 g (hoặc 1 ml) mẫu.

- Coliforms chịu nhiệt:
Dùng khuyên cấy cấy chuyển dịch mẫu từ các ống canh Lauryl sulphate
có sinh hơi sang môi trường canh EC, ủ ở 44.5o
C ± 0.2 0
C/1 ngày. Đọc số
lượng các ống cho kết quả dương tính(ống sinh hơi). Số ống nghiệm cho phản
ứng dương tính của các nồng độ pha loãng được tra theo bảng MPN để xác
định tổng số Coliforms chịu nhiệt trong 1 g (hoặc 1 ml) sản phẩm.
- Coliforms phân:
Dùng khuyên cấy cấy chuyển dịch mẫu từ các ống có sinh hơi trên môi
trường canh EC sang môi trường canh Trypton, ủ ở 44.5o
C ± 0.2o
C/1ngày. Nhỏ
thuốc thử Kovac’s vào các ống nghiệm Trypton đã ủ. Phản ứng dương tính khi
có màu đỏ xuất hiện trong môi trường trong vòng vài phút. Đọc số lượng các
ống cho kết quả dương tính. Số ống nghiệm cho phản ứng dương tính của các
nồng độ pha loãng được tra theo bảng MPN để xác định tổng số Coliforms
phân trong 1g (hoặc 1ml) mẫu.
Các chú ý và giới hạn của phương pháp:
Phương pháp MPN thông qua phản ứng lên men lactose không định
lượng được vi sinh vật thuần chủng. Kết quả sai có thể xảy ra do sự có mặt của
các vi sinh vật lên men lactose khác. Không nên cấy chuyển các bọt bóng có
sau quá trình đồng nhất mẫu vào môi trường nuôi cấy.
Sau khi chuyển dịch pha loãng mẫu vào ống Lauryl tryptose nên xoay từ
từ ống nghiệm để dịch dính ở thành ống đi xuống.
Có thể có kết quả âm tính giả do sự có mặt của các Coliforms không lên
men lactose.
Nhiệt độ bể điều nhiệt cần được duy trì ở 44.50
C và mực nước phải trên
mực dung dịch trong các ống nghiệm. Nhiệt độ ủ ấm rất quan trọng, sự thay đổi
chút ít có thể làm thay đổi loại và số lượng vi sinh vật phát triển trong môi
trường thử nghiệm.
Các chủng loại chuẩn E. coli và Enterobacter aerogenes cấy song song
với phép thử sẽ chỉ ra sự sai lệch của nhiệt độ bể điều nhiệt. Nhiệt độ cao sẽ
dẫn đến sự lên men của E.coli sai. Sự lên men lactose của E. aerogenes chỉ ra
nhiệt độ ủ thấp hơn 44.50
C.
Định lượng E.coli bằng Lauryl tryptose broth có thể xuất hiện âm tính
giả do E.coli bị tổn thương trong quá trình chế biến thực phẩm.
Nên sử dụng chủng chứng và kiểm soát môi trường trong suốt quá trình
thử nghiệm.

4.4 Định lượng Enterococci đường ruột trong nước bằng phương
pháp màng lọc
Enterococci đường ruột là các vi khuẩn có khả năng phân giải 2,3,5-
triphenyltetrazolium chloride tạo thành formazan và thuỷ phân aesculin ở 440
C
trên môi trường quy định tại phương pháp này.
Lọc, nuôi cấy và đếm:
Đếm Enterococci đường ruột dựa trên việc lọc một thể tích xác định của
mẫu nuớc qua một màng lọc có kích thước lỗ thích hợp (0,45 μm) để giữ lại
các vi khuẩn. Màng lọc được đặt vào trong môi trường thạch chọn lọc chứa
natri azide (để ngăn chặn sự sinh trưởng và phát triển của các vi khuẩn gram
âm) và 2,3,5-triphenyltetrazolium chlorua (một chất nhuộm không màu).
Enterococci đường ruột sẽ khử thuốc nhuộm không màu thành focmazan đỏ.
Sau khi nuôi cấy ở 36.0 ± 2.00
C/ 44 ± 4 h, đếm tất cả các khuẩn lạc mọc
màu đỏ, màu hạt dẻ hoặc màu hồng.
Khẳng định:
Chuyển màng lọc có các khuẩn lạc vào môi trường bile-aesculin-azide agar,
ủ ở 44.0 ± 0,50
C. Enterococci đường ruột thuỷ phân aesculin trong môi trường
trong 2 giờ, sản phẩm cuối cùng là 6,7 - dihidroxycoumarin sẽ kết hợp với ion sắt
(III) cho hợp chất màu nâu vàng đến đen và khuếch tán vào môi trường.
Môi trường nuôi cấy:
- Môi trường Slanetz and Bartley
- Thạch mật aesculin - azide
Thiết bị:
- Thiết bị màng lọc
- Màng lọc vô trùng với kích thước lỗ 0,45μm.
- Tủ ấm 36.0 ± 2.00
C
- Tủ ấm 44.0 ± 0.50
C
Quy trình tiến hành:
Chuẩn bị:
Chuẩn bị mẫu, thiết bị lọc vô trùng và môi trường nuôi cấy. Mẫu nên được
phân tích ngay sau khi lấy. Nếu mẫu bảo quản ở nhiệt độ phòng (250
C) thì
không được bảo quản quá 6 giờ, nếu mẫu bảo quản ở nhiệt độ 5 ± 30
C thì
không được quá 24 giờ trước khi phân tích.
Lọc và nuôi ủ
Lọc một thể tích nước thích hợp.
Điều chỉnh các dịch pha loãng sao cho các khuẩn lạc có thể mọc tách biệt
ra và dễ dàng đếm được.

Sau khi lọc, tháo màng bằng kẹp đã khử trùng và đặt màng lọc lên mặt
thạch Slanetz and Bartley. Nuôi các đĩa ở 36.0 ± 2.00
C trong 44 giờ ± 4 giờ.
Khẳng định và đếm :
Sau khi nuôi, đếm tất cả các khuẩn lạc có màu nâu đỏ hoặc màu hồng từ
trung tâm hoặc toàn bộ khuẩn lạc.
Nếu trên màng có các khuẩn lạc đặc trưng, chuyển màng lọc sang môi
trường bile –aesculin-azide agar đã được ủ ấm đến 440
C (không lật ngược
màng), ủ ở 44.00
C ± 0.50
C trong 2 giờ.
Đọc kết quả ngay. Tất cả các đĩa cho khuẩn lạc có màu từ nâu đến đen, hoặc
môi trường bao quanh có màu nâu hay đen được coi là phản ứng dương tính.
Báo cáo kết quả:
Kết quả biểu thị bằng số vi khuẩn Enterococci đường ruột trong một đơn
vị thể tích mẫu và được tính theo hướng dẫn trong ISO 8199.
Các chú ý và giới hạn của phương pháp
Bile-aesculin-azide-agar có chứa Natri azide. Do Natri azide có độc tính
cao nên chú ý khi thực hiện cần tránh tiếp xúc trực tiếp với hoá chất đó, đặc
biệt không được hít các hạt bụi của môi trường trong quá trình pha chế môi
trường tổng hợp. Môi trường có chứa azide không nên pha với các axit vô cơ
mạnh bởi vì nó có thể tạo ra chất độc HN3. Dung dịch chứa azide cũng có thể
hình thành nnên hợp chất gây nổ khi tiếp xúc với các ống dẫn bằng kim loại.
Màng lọc được làm từ cellulose và có đường kính mắt lưới khoảng 47-
50mm.
Màng lọc phải đảm bảo không có tính chất ức chế hoặc kích thích sự phát
triển của vi khuẩn, mực in sử dụng để in các mắt lưới trên màng lọc cũng
không được ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn. Nếu chưa vô trùng thì
chúng cần phải được khử trùng theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Việc sử dụng
màng lọc của các hãng khác nhau có thể dẫn đến việc hình thành màu sắc khác
nhau của vi khuẩn trên màng.
4.5 Định lượng Clostridium khử sunfite trong nước bằng phương pháp
tăng sinh trong môi trường cấy lỏng
Giống Clostridium thuộc họ Bacillaceace bao gồm các đặc điểm như sau:
sinh bào tử, phần lớn di động, gram dương, hình que, kị khí. Hiện diện trong
phân của động vật và người, trong nước thải và trong đất. Các bào tử của vi
sinh vật này sống sót trong nước rất lâu vì chúng bền vững hơn các dạng tế bào
sinh dưỡng đối với các tác động của các yếu tố vật lý và hóa học. Vì vậy chúng
có thể làm chỉ thị về sự ô nhiễm nước. Chúng thậm chí bền với cả chlorin ở
mức thường vẫn được sử dụng để xử lý nước.

Nguyên tắc: Số lượng vi khuẩn Clostridium được xác định trong một thể
tích nước xác định theo các bước tăng sinh trong môi trường cấy lỏng, nuôi
trong điều kiện kị khí.
Môi trường:
- Môi trường phân lập: DRCM nồng độ kép và nồng độ đơn.
- Dung dịch pha loãng- nước muối pepton (saline pepton)
Dụng cụ và thiết bị:
- Máy dập mẫu.
- Bể điều nhiệt 75±50
C.
- Tủ ấm 37±1.00
C.
- Bình kị khí với thiết bị tạo điều kiện kị khí.
Tiến hành thử nghiệm:
Xử lý mẫu: Mẫu được xử lý nhiệt bằng cách đun nóng trong bể điều nhiệt
ở 75o
C + 5 trong 15-20 phút kể từ lúc đạt nhiệt độ trên, để giảm bớt thể dinh
dưỡng của vi khuẩn.
Cấy mẫu và nuôi ấm: Cấy 50ml mẫu nước ban đầu vào 50ml canh DRCM
nồng độ kép. Cấy 10ml mẫu nước ban đầu vào 5 ống nghiệm, mỗi ống chứa 10
ml canh DRCM đặc. Cấy 1ml mẫu nước ban đầu vào 5 ống nghiệm, mỗi ống
chứa 25 ml canh DRCM đơn. Nếu nghi ngờ lượng vi sinh vật trong mẫu quá
cao, phải tăng độ pha loãng mẫu.
Nếu cần, đổ lên mặt tất cả các ống đã cấy một lượng canh DRCM đơn để
thể tích chất lỏng đầy ống và đảm bảo rằng chỉ còn lại một thể tích nhỏ không
khí, sau đó gắn kín các ống nghiệm và các bình, hoặc đem nuôi trong điều kiện
kị khí, ủ ở 37.0 + 1.00
C/44 + 4 giờ.
Bổ sung các đoạn dây thép - được nung đỏ đặt vào môi trường trước khi
cấy mẫu vào, có thể tạo điều kiện cho sinh vật kị khí phát triển.
Đọc và báo cáo kết quả: Các lọ trong đó thấy có vệt đen được coi là
dương tính. Kết quả biểu thị theo số có xác suất cao nhất (MPN) của
Clostridium khử Sulfite trên thể tích mẫu thử.

KẾT LUẬN
Hàng năm Việt Nam có khoảng hơn 3 triệu trường hợp nhiễm độc từ thực
phẩm, gây thiệt hại hơn 200 triệu USD (WHO), hơn 70% số ca do vi sinh vật
gây nên, do đó việc xác định vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm (định tính,
định lượng) là rất cần thiết cho công tác ngăn chặn, phòng ngừa và giảm thiệt
hại gây ra bởi ngộ độc thực phẩm.
Có nhiều phương pháp để định lượng vi sinh vật, mỗi phương pháp đều có
những ưu, nhược điểm riêng và được dùng để định lượng những vi sinh vật
nhất định, do đó cần có sự nghiên cứu về đặc điểm sinh học của vi sinh vật để
có thể áp dụng đúng phương pháp định lượng, đem lại hiệu quả cao nhất.
Bài tiểu luận sử dụng số liệu của Cục an toàn vệ sinh thực phẩm - Bộ y tế
và các phương pháp định lượng của Cục quản lý chất lượng nông, lâm sản &
thủy sản - Bộ NN&PTNT.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Nguyễn Tiến Dũng, 2007, Phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật trong
thực phẩm, ĐH KHTN-ĐH QGHCM.
2. Trần Xuân Hiền, 2001, Đánh giá chất lượng thực phẩm, ĐH Nông Lâm
TpHCM.
3. Lâm Quốc Hùng, Tạ Ngọc Thanh, 2009, Một số đặc điểm dịch tễ học các
vụ ngộ độc thực phẩm trong toàn quốc từ năm 2002 đến năm 2008, Cục
An toàn vệ sinh thực phẩm - Bộ Y tế.
4. Lê Thanh Mai, 2006, Kiểm tra vi sinh trong công nghệ thực phẩm, ĐH
BKHN.
5. Lương Đức Phẩm, 2005, Vi sinh vật học và an toàn vệ sinh thực phẩm,
NXB Nông nghiệp.
6. TCVN 17025.053, 2005, Văn phòng công nhận chất lượng.
7. Sổ tay Phương pháp vi sinh, 2009, Cục quản lý chất lượng nông lâm thủy
sản.

PHỤ LỤC
Phụ lục 1. Các chỉ tiêu vi sinh vật trong thực phẩm được quy định bởi tiêu
chuẩn của Bộ Y tế (Bảng 1) bao gồm các chỉ tiêu sau: tổng số vi khuẩn hiếu
khí, Coliforms, E.coli, Staphylococcus aureus, Salmonella, Vibrio
parahaemolyticus, Bacillus cereus, Streptococcus faecalis, Pseudomonas
aeruginosa, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, tổng số nấm men,
nấm mốc… Quy định về giới hạn cho phép của các chỉ tiêu thay đổi theo nhóm
và chủng loại thực phẩm.
Phụ lục 2. Kết quả giám sát vi sinh vật trong một số loại thực phẩm do
Cục An toàn vệ sinh thực phẩm tiến hành năm 2006 (Bảng 2) và 2007 (Bảng 3)
Phụ lục 3. Hệ thống phương pháp phân tích vi sinh vật – Cục Quản lý chất
lượng nông lâm thủy sản, Bộ NN&PTNT.
Phụ lục 4. TCVN (7048,7049,7050) đối với các sản phẩm thịt.

Bảng 1. Tiêu chuẩn vi sinh cho phép trong thực phẩm, Bộ Y tế 4/1998
Giới hạn cho phép (CFU/g hoặc CFU/ml thực phẩm)
Nhóm thực phẩm TVKH
K
EC
O
SAU
SAL/25
g
BC
E
CO
L
CP
E
VP
A
NM–
MO
SF
A
PA
E
CB
O
106
102
102
0 102
Nhóm thịt:
-Thịt tươi, thịt đông lạnh, thịt xay
nhỏ, thịt nghiền, thịt chế biến.
-Sản phẩm chế biến từ thịt: thịt
hun khói, pate, xúc xích.
3. 105
3 10 0 10 50 10
106
102
102
0 102
102
105
3 10 0 10 10 10 10
Nhóm cá và hải sản:
-Cá và thủy sản tươi sống
-Sản phẩm chế biến: tôm, cá hấp
nóng hun khói, chả cá, chả mực,
các loại giáp xác, nhuyễn thể
luộc hấp.
-Thủy sản khô sơ chế: cá khô 106
10 102
0 102
20
102
105
3 10 0 102
Nhóm trứng:
-Trứng tươi, dịch trứng tươi hoặc
đông lạnh.
-Sản phẩm chế biến từ trứng (đã
tiệt trùng bằng phương pháp
Pasteur)
103
0 3 0 10

5. 104 0 0 0 10
5. 104 3 0 10
10
0 0 0 0
Nhóm sữa:
-Sữa khô, sữa bột
-Sữa tươi tiệt trùng theo phương
pháp Pasteur.
-Sữa tươi tiệt trùng theo phương
pháp UHT
-Sản phẩm chế biến từ sữa (bơ,
sữa chua, phomat)
104
0 0 0 10
106
102
102
102
103
102
103
Sản phẩm chế biến từ ngũ cốc, khoai
củ, đậu đỗ:
-Cần sử lý nhiệt trước khi dùng
-Dùng trực tiếp, không xử lý
nhiệt: bánh bột. 104 3 10 10 10 10 102
10 0 0 0 0 0
102
0 0 10 0 10 0 0
Nhóm nước khoáng và nước giải
khát đóng chai:
-Nước giải khát có cồn
-Nước giải khát không cồn
-Nước khoáng đóng chai
Theo
G.M.P 0 0 0 0
Nhóm gia vị:
104
3 102
0 102
102

104
0 3 0 102
10 10
Nhóm nước chấm:
-Nguồn gốc động vật: nước mắm
-Nguồn gốc thực vật
104
0 3 0 102
10 10
105
10 102
0 102
10
Nhóm thức ăn khô và chứa dinh
dưỡng cho trẻ em, thức ăn thay thế
đặc biệt:
-Phải xử lý nhiệt trước khi sử
dụng
-Dùng trực tiếp không qua xử lý
nhiệt
104
0 3 0 10 10 10
Kem, nước đá 5. 104
0 10 0 102
10
Nhóm đồ hộp 0 0 0 0 0
Nhóm dầu mỡ 103
3 0 0 10 0
TVKHK: tổng vi khuẩn hiếu khí; ECO: E.coli; SAU: Staphylococcus aureus; SAL: Salmonella; BCE: Bacillus cereus; COL:
Coliforms; CPE: Clostridium perfringens; VPA: Vibrio parahaemolyticus; NM – MO: tổng số nấm men, nấm mốc; SFA:
Streptococcus faecalis; PAE: Pseudomonas aeruginosa; CBO: Clostridium botulinum;
G.M.P: Goof Manufacturing Practice: quy phạm sản xuất GMP

Bảng 2 Kết quả giám sát chủ động – mẫu vi sinh 2006
Stt Tên mẫu Tổng số
mẫu
Đạt Không
đạt
Chỉ tiêu không đạt
1 Thịt tươi 40 6 34 Coliforms, E.coli,
S.aureus
2 Thủy sản khô sơ chế 17 8 9 Coliforms, E.coli,
S.aureus
3 Thủy sản tươi 13 9 4 Coliforms, E.coli,
4 Bánh ăn liền các loại 37 16 21 Coliforms, E.coli,
S.aureus, Cl. Perfringen,
B. cereus, TSNM- NM
5 Nước giải khát các loại:
nước mía, rau má, nước
sâm, nước sinh tố….
20 0 21 Coliforms, E.coli,
S.aureus, Cl. Perfringen,
S. feacalis, TSNM- NM
Tổng cộng : 127 39
(30,7%)
88
(69,3%)
Nhận xét: 88/127 mẫu được kiểm tra không đạt các chỉ tiêu vi sinh trọng điểm
Coliforms, E.coli, S.aureus, C. perfringens, B. cereus, S. fecalis, TSBT mốc – men

Bảng 3 Kết quả giám sát chủ động – mẫu vi sinh 2007
STT
Tên sản
phẩm
Tổng
số
mẫu
Kết
quả đạt
Coliforms E. coli
S.
aureus
C.
perfringens
S.
fecalis
1
Nem
chua lá
chuối
3 1 2 1 0 0
0
2
Nem
chua hộp
3 1 2 2 0 0 0
3 Jambon 20 0 20 15 1 0 0
4 Bì thính 14 8 6 1 0 0 0
5
Nem
chua cây
2 0 2 0 0 0 0
6 Nem bì 11 2 9 5 1 3 0
7
Nem
chua
20 5 15 8 4 7 0
Tổng cộng 73
17
(23,3%)
56
(76,7%)
31
(42,5%)
6
(8,2%)
10
(13,7%)
0
(0,0%)
Nhận xét:
Có 56/73 mẫu được kiểm tra (76,7%) không đạt chỉ tiêu vi sinh ( xét nghiệm các chỉ tiêu
vi sinh trọng điểm: Coliforms, E. Coli, S. Aureus, C. Perfringens)
STT
Tên sản
phẩm
Tổng số
mẫu
Đạt Không đạt Ghi chú
1
Mắm thái
16
6
(37,5%)
10
(62,5%)
Chỉ tiêu không đạt:
C. Perfringens
2
Mắm cá các
loại
74
51
(68,9%)
23
(31,1%)
C. Perfringens
3
Mắm ruốc
23
15
(65,2%)
8
(34,8%)
C. Perfringens
4
Mắm tôm
chua
6
3
(50%)
3
(50%)
C. Perfringens
5
Mắm ba khía
8
3
(37,5%)
5
(62,5%)
C. Perfringens
6
Mắm tôm,
mắm tép
11
8
(72,7%)
3
(27,3%)
C. Perfringens
7
Mắm bồ hốc
xay
5
3
(60%)
2
(40%)
C. Perfringens
Tổng cộng 143
89
(62,2%)
54
(37,8%)
Nhận xét: Không phát hiện Vibrio cholerae, V. Parahaemolyticus trong số mẫu được kiểm
tra.
Có 54/143 mẫu được kiểm tra (37,8%) nhiễm C. Perfringens.Đặc biệt ở mắm ba khía và
mắm thái có tỷ lệ nhiễm trên 62%.

Vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm

More Related Content

What's hot (20)

Similar to Vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm (20)

More from https://www.facebook.com/garmentspace (20)

Recently uploaded (20)

Vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm