Bài 8

Bài 8

• 1.
  Bài 8: NHÓMENZYME 1. Tổng quan 1.1. Nguyên liệu - Dứa (thơm) có tên khoa học là Ananas comosus, là một loại quả nhiệt đới. Quả dứa có hàm lượng acid hữu cơ cao (acid malic và acid citric). Dứa là nguồn cung cấp mangan dồi dào cũng như hàm lượng Vitamin C và Vitamin B1 khá cao. - Giá trị dinh dưỡng trong 100g phần ăn được Năng lượng 202 kJ (48kcal) Cacbohydrat 12.63 g Đường 9.26 g Chất xơ thực phẩm 1.4 g Chất béo 0.12 g Protein 0.54 g Thiamin (Vit. B1) 0.079 mg Riboflavin (Vit.B2) 0.031 mg Niacin (Vit.B3) 0.489 mg Acid pantothenic (Vit. B5) 0.205 mg Vitamin B6 0.110 mg Acid folic (Vit. B9) 15μg Vitamin C 36.2 mg Canxi 13 mg Sắt 0.28 mg Magie 12 mg Phosphor 8 mg Kali 115 mg Kẽm 0.10 mg - Trong quả dứa có chứa enzyme bromelain, có thể phân hủy protein. Do vậy, quả dứa được sử dụng trong chế biến món ăn như thịt bò xào, thịt vịt xào giúp thịt nhanh mềm và tạo hương vị đặc trưng. 1.2. Phụ gia sử dụng - Pectinase là một nhóm enzyme thủy phân các chất pectin, sản phẩm tạo thành là acid galacturonic, galactose, metanol. Enzyme pectinase được tìm thấy ở thực vật bậc cao, pectinase có nhiều trong lá, củ khoai tây, trong chanh, cà chua dứa, cỏ ba lá.
• 2.
  - Lượng chếphẩm pectinase trên lượng nguyên liệu đem chế biến khoảng 0.03-0.05%, có khi lên tới 0.1%. - Cơ chế tác dụng: Tùy vào từng loại enzyme mà có các cơ chế tác dụng khác nhau 1.2.1. Pectinesterase Pectinesterase còn được gọi là pectinmethyl hydrolase, xúc tác sự khử ester hoá nhóm methoxyl của pectin, tạo thành acid pectic. Enzym này hoạt động đặc hiệu với nhóm methyleste của acid galacturonic nằm bên cạnh acid galacturonic không bị este hoá. 1.2.2. Protopectinase Protopectinase hòa tan protopectin, tạo thành các pectin hòa tan có mức độ polymer cao. 1.2.3. Các enzym khử mạch polymer Chia làm 2 tiểu nhóm: a. Enzym thủy phân liên kết glycoside (Hydrolase)  Polymethylgalacturonase (PMG): xúc tác thuỷ phân liên kết α-1-4-glycosid đặc hiệu với pectin có mức độ ester hoá cao. Polymethylgalacturonase gồm 2 loại: - Endo-PMG: phân cắt ngẫu nhiên liên kết α-1,4-glycosid của pectin. - Endo-PMG: phân cắt ngẫu nhiên liên kết α-1,4-glycosid của pectin.  Polygalacturonase (PG): xúc tác thuỷ phân liên kết α-1,4- glycosid của acid pectic (acid polygalacturonic), gồm 2 loại: - Endo-PG: còn gọi là poly (1,4-α-D-galacturonide) glycanohydrolase, xúc tác thuỷ phân ngẫu nhiên liên kết α-1,4- glycosid trong phân tử acid pectic. - Exo-PG: còn gọi là poly (1,4-α-D-galacturonide) glalacturonohydrolase, xúc tác thuỷ phân lần lượt liên kết α- 1,4-glycosid của acid pectic từ đầu không khử. b. Enzyme cắt (Lyase)  Polymethylgalacturonate lyase (PMGL): Xúc tác phá vỡ liên kết α-1-4-glycosid đặc hiệu với pectin có mức độ ester hoá cao, có hai loại: - Endo-PMGL: còn gọi là poly(methoxygalacturonide) lyase, xúc tác phân cắt ngẫu nhiên liên kết α-1,4-glycosid của pectin. - Exo- PMGL: xúc tác phá vỡ từng nấc phân tử pectin.
• 3.
   Polygalacturonate lyase(PGL): xúc tác phá vỡ liên kết α-1,4- glycosid của acid pectic. Có 2 loại: - Endo- PGL: còn gọi là poly(1,4-α-D- galacturonide) lyase, xúc tác phân cắt ngẫu nhiên liên kết α-1,4-glycosid của acid pectic. - Exo- PGL: còn gọi là poly(1,4-α-D- galacturonide) exolyase, xúc tác phân cắt lần lượt liên kết α-1,4-glycosid của acid pectic từ đầu không khử. 2. Kết quả và biện luận Thuyết minh qui trình: - Xử lí: Mục đích: Xử lí nguyên liệu nhằm tạo thuận lợi cho những khâu tiếp theo, loại bỏ những phần không dùng được. Thực hiện: Ta loại bỏ vỏ và mắt dứa, sau đó đem rửa nhằm loại sạch nguyên liệu và loại bỏ bẩn bám trên nguyên liệu. - Cắt nhỏ: Mục đích: Làm nhỏ nguyên liệu, thuận lợi cho quá trình xay nhuyễn sau này. Thực hiện: Ta dùng dao cắt dứa thành những miếng nhỏ. - Xay nhuyễn: Mục đích: nhằm phá vỡ cấu trúc tế bào để tách chiết dịch được dễ dàng hơn. Thực hiện: Nguyên liệu sau khi được cắt nhỏ đem xay min bằng máy xay sinh tố với tỉ lệ nước : dứa = 1:2. - Lọc Mục đích: nhằm tách loại bã để thu dịch quả. Thực hiện: Lọc bằng máy lọc chân không. 80g dứa, 160g nước M0 M1: 0.05% pectinase M2: 0.1% pectinase
• 4.
  M0 M1 M2 Thể tích dịch lọc (ml) 189 201 206 Khối lượng bã lọc thu được (g) 13.863 12.273 11.106 oBx 3.0 3.5 4 Độ nhớt (s) 20.03 19.13 14.18 pH 4 3.5 3.7 Màu sắc Vàng tươi nhất Vàng nhạt Vàng nhạt Trạng thái Đục nhất Trong Trong nhất Thời gian chảy của nước: 18s Mức độ giảm độ nhớt của dung dịch khi sử dụng pectinase 푁(%) = 퐸푇0 − 퐸푇푡 퐸푇0 − 퐸푇푤 × 100 Khi sử dụng 0.05% pectinase: 푁 = 20.03 − 19.18 20.03 − 18 × 100 = 41.87% Khi sử dụng 0.1% pectinase: 푁 = 20.03 − 19 20.03 − 18 × 100 = 50.74% - Thể tích dịch sau khi lọc tăng từ mẫu M0, M1, M2 vì xử lí enzyme làm tăng hiệu suất chiết rút dịch quả. - Độ brix tăng vì xử lí enzyme làm tắng hàm lượng chất khô hòa tan vào dịch quả nên làm cho độ Bx tăng. - Độ nhớt giảm dần do dưới tác dụng của enzyme phân giải pectin thành các chất hòa tan.
• 5.
  - Màu vàngcàng nhạt, độ trong tăng dần dưới tác dụng của enzyme pectinase phân giải protopectin thành dạng pectin hòa tan nên làm dịch quả trong hơn, màu nhạt hơn. 3. Trả lời câu hỏi 3.1. Vai trò của enzyme pectinase Enzyme pectinase là một nhóm enzyme thuỷ phân các chất pectin, sản phẩm tạo thành là acid galacturonic, galactose, methanol… Sự phân hủy pectin trong tự nhiên thường xảy ra khi trái cây chín. Những enzyme này có vai trò hết sức quan trọng trong quá trình bảo quản trái cây và rau quả. Enzyme pectinase cũng được ứng dụng nhiều trong quá trình chế biến thực phẩm, đặc biệt là khả năng làm trong nước quả. Việc kiểm soát hoạt động của enzyme pectinase cũng có thể kiểm soát được độ nhớt của sản phẩm. Vai trò của enzyme pectinase là hoạt động thủy phan pectin của enzyme đã làm giảm độ nhớt trong nước trái cây vì thế nồng độ của các thành phần chất tan trong dịch quả tăng lên vì thế mà tăng hiệu suất trích li và giá trị Brix của sản phẩm cũng tăng lên. 3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme - Nhiệt độ: Hoạt động thủy phân của enzyme pectinase ở 40 – 50oC là cao nhất. Khi tăng hay giảm nhiệt độ thì hiệu suất thu hồi giảm. - pH: Enzyme pectinase hoạt động mạnh nhất ở pH 4.5. Ở các khoảng còn lại, lượng dịch thu được giảm. - Nồng độ enzyme: Lượng dịch quả trung bình thu được ứng với các mức nồng độ enzyme có sự khác biệt. Lượng dịch quả cao nhất ứng với mức nồng độ enzyme sử dụng dao động trong khoảng từ 0.15% đến 0.2%. Lượng dịch quả có xu hướng giảm dần khi nồng độ enzyme cao hơn hoặc thấp hơn. - Thời gian thủy phân: Cần có một khoảng thời gian tối thiểu để enzyme hoạt động, tạo ra lượng dịch quả nhiều nhất. - Chất ức chế hoặc hoạt hóa enzyme: một số chất như thuốc trừ sâu có thể làm ức chế enzyme hay một số chất khác có thể liên kết với enzyme để làm tăng hoạt tính. 3.3. Ngoài pectinase, có thể sử dụng enzyme nào để tăng hiệu suất thu hồi dịch quả?
• 6.
  - Enzyme protease:Nó sử dụng cơ chất là pectin và sản phẩm sau khi thủy phân là acid pectic và methanol trong quá trình bảo quản lạnh. Giảm tức thời độ đục nhưng độ trong giảm khi bảo quản lạnh. - Hemicellulose, cellulose… - Các loại enzyme khác như: pectinex Smash, Enzeco… 3.4. Trình bày các tác hại có thể xảy ra khi sử dụng quá nhiều hoặc quá ít enzyme. Lượng dịch quả có xu hướng giảm dần khi nồng độ enzyme thấp hơn hoặc cao hơn. Nếu quá nhiều enzyme sẽ làm cản trở vận tốc phản ứng, lãng phí enzyme. Nếu quá ít enzyme thì thời gian thủy phân sẽ kéo dài và hiệu suất thu hồi dịch quả kém. 3.5. Pectinase có thể ứng dụng trong những sản phẩm thực phẩm nào? - Sản xuất nước quả - Sản xuất rượu vang đỏ - Lên men trà và cà phê: việc thêm pectinase cũng làm cải thiện đặc tính của bột trà bằng cách phân hủy pectine trà. Trong cà phê sử dụng loại lớp vỏ nhầy khỏi hạt cà phê. - Sản xuất tinh dầu: sử dụng enzyme làm tăng sản lượng dầu ôliu do tác dụng làm hóa lỏng thành cấu trúc của tế bào. 3.6. Tác hại có thể xảy ra khi sử dụng sai những phụ gia trong bài thí nghiệm. Có thể không làm trong được dịch quả sau khi lọc. 3.7. Phương pháp xác định pectinase - Nuôi cấy thu nhận enzyme pectinase từ phương pháp nuôi cấy bề mặt. - Xác định hoạt độ enzyme pectinase bằng phương pháp đo độ nhớt với nhớt kế Borosil: hút 2ml dung dịch enzyme thô 5% (w/v) phản ứng với 18ml dung dịch pectin 1% ở pH 4.5 và nhiệt độ 40oC. Một đơn vị hoạt độ pectinase (UI) là lượng enzyme cần thiết làm giảm 10% độ nhớt của hỗn hợp chứa 180mg pectin dưới những điều kiện như trên. - Hàm lượng protein của chế phẩm enzyme được xác định bằng phương pháp Lowry. - Phân tích chế phẩm enzyme bằng phương pháp lọc gel Bio Gel P30: Hòa tan chế phẩm enzyme thô trong đệm Mc Ilvaine pH 4.5 ly tâm bỏ cặn thu được dung dịch enzyme sau đó hút 0,5ml cho chạy qua cột Bio Gel P 30 (0.8 x 30cm) (hãng Biorad – Mỹ) được cân bằng với đệm Mc Ilvaine pH 4,5. Tốc độ chảy qua cột lần lượt là 30ml/giờ và 15ml/giờ. Mỗi phân đoạn thu 2ml và 1,5ml. Đo độ hấp thu A của từng phân đoạn ở bước sóng
• 7.
  280nm. Vẽ đồthị ghi nhận các peak tạo thành và xác định hiệu suất thu hồi enzyme và hoạt độ tính tương ứng. - Tinh sạch enzyme pectinase bằng phương pháp lọc màng (cross flow membrance): Tiến hành tủa enzyme từ 500ml dịch chiết thu được bởi ethanol 96o, nhiệt độ tủa 4oC, thời gian tủa là 1 giờ. Sau đó, ly tâm 5000 vòng/phút trong 15 phút thu enzyme thô. Hòa tan enzyme thô này trong 500ml dung dịch đệm Mc Ilvaine pH 4.5. Tiến hành lọc 500ml dung dịch enzyme vừa hòa tan trên bằng hệ thống lọc QuixStand Benchtop Systems (hãng Amersham Biosciences) với bộ lọc màng (membrane) có khoảng phân đoạn 50kDa. Tốc độ bơm mẫu đầu vào lần lượt là 150rpm & 200rpm và điều chỉnh sao cho áp suất trên bề mặt màng không quá 5 Psi. Thu dịch qua lọc và xác định hiệu suất thu hồi enzyme và hoạt độ tương ứng. 3.8. Kể tên vài loại thực phẩm và enzyme bổ sung thường gặp - Ứng dụng protease trong sản xuất bia: thủy phân protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện xử lí bia tốt hơn. - Ứng dụng protease trong sản xuất phomat từ sữa, sản xuất bánh từ bột mì, chế phẩm giàu protein từ đậu tương. - Ứng dụng pectinase trong sản xuất nước dứa, nước táo ép… 3.9. Nêu giá trị INS, ADI, ML của pectinase, protease?