Báo cáo thực tập (2)

ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC HUẾ
KHOA HÓA
Báo cáo Niên luận Thực tập Thực tế
XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CAFEIN TRONG CÀ PHÊ
BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
Bùi Thị Như Phụng
Khóa 2014 - 2018
Huế, 6/2017

ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC HUẾ
KHOA HÓA
Báo cáo Niên luận Thực tập Thực tế
XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CAFEIN TRONG CÀ PHÊ
BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
Giảng viên hướng dẫn: Thầy Lê Trung Hiếu
Cán bộ hướng dẫn: KNV Huỳnh Thị Túy Ngọc
Sinh viên thực hiện: Bùi Thị Như Phụng
Khóa 2014 - 2018
Huế, 6/2017

i
LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên em xin kính cám ơn các thầy cô trong trong khoa Hóa- trường Đại học
Khoa học và đặc biệt là các thầy cô trong bộ môn Hóa Hữu cơ đã tận tình giảng dạy,
tạo điều kiện cho em được tham gia chuyến thực tập thực tế này. Chuyến thực tập thực
tế này thật sự rất có ý nghĩa đối với em, giúp em vận dụng những lý thuyết đã học vào
thực tế, gặt hái được nhiều kinh nghiệm trong học tập cũng như các kĩ năng trong cuộc
sống và đặc biệt là xác định được ngành nghề, công việc mình đảm nhiệm sau khi tốt
nghiệp.
Em cũng xin cám ơn Trung tâm kiểm nghiệm Thuốc, Mỹ phẩm, Thực phẩm
Thừa Thiên Huế đặc biệt là các anh chị kiểm nghiệm viên đã tận tình chỉ dạy, cho em
được cơ hội thực hành và các kỹ năng, kinh nghiệm mà sách vở không có.
Cám ơn các bạn trong nhóm thực tập đã giúp đỡ, nhắc nhở, động viên nhau
trong quá trình thực tập, giúp hoàn thành tốt đợt thực tập thực tế này.
Vì đây là lần đầu tiên được tiếp xúc với công việc nên trong quá trình chắc chắn
có xảy ra sai sót. Em rất mong nhận được sự góp ý của quý thầy cô và trung tâm, giúp
cho bài niên luận của em hoàn chỉnh hơn và đó cũng là kinh nghiệm quý báu sau khi
em ra trường.
Em xin chân thành cám ơn!
Huế, tháng 6 năm 2017
Sinh viên thực hiện
Bùi Thị Như Phụng

ii
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN...................................................................................................................i
MỤC LỤC...................................................................................................................... ii
MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1
1. TRUNG TÂM KIỂM NGHIỆM THUỐC, MỸ PHẨM, THỰC PHẨM THỪA
THIÊN HUẾ....................................................................................................................2
1.1. Giới thiệu..............................................................................................................2
1.2. Chức năng và nhiệm vụ chính của Trung tâm: .....................................................2
1.2.1. Chức năng.......................................................................................................2
1.2.2. Nhiệm vụ.........................................................................................................2
1.3. Giới thiệu về tình hình hoạt động và cơ cấu tổ chức ............................................4
1.3.1. Tình hình hoạt động........................................................................................4
1.3.2. Cơ cấu tổ chức ................................................................................................4
1.3.3. Biên chế ..........................................................................................................5
2. GIỚI THIỆU VỀ ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH........................5
2.1. Cafein ....................................................................................................................5
2.2. Các phương pháp phân tích cafein........................................................................7
3. TỔNG QUAN LÝ THUYẾT VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG
CAO (HPLC)...................................................................................................................7
3.1. Giới thiệu về phương pháp (HPLC)......................................................................7
3.2. Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống máy HPLC ......................................................8
3.3. Nguyên tắc hoạt động của phương pháp HPLC.................................................11
3.4. Các đại lượng quan trọng của sắc ký đồ ............................................................12
3.4.1. Thời gian lưu (tR) ......................................................................................12
3.4.2. Số đĩa lỹ thuyết (N)...................................................................................12
3.4.3. Hệ số không đối xứng T............................................................................13
3.4.4. Diện tích peak (S), chiều cao peak (h)......................................................13
3.5. Định lượng bằng HPLC ...................................................................................13
3.5.1. Phương pháp so chuẩn ..............................................................................13
3.5.2. Phương pháp đường chuẩn........................................................................14
4. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CAFEIN TRONG CÀ PHÊ BỘT BẰNG ................15
PHƯƠNG PHÁP HPLC................................................................................................15

iii
4.1. Xác định hàm lượng Cafein trong Cà phê bột bằng phương pháp HPLC trong
thực nghiệm................................................................................................................15
4.1.1. Nguyên lý:.................................................................................................15
4.1.2. Thiết bị và dụng cụ:...................................................................................15
4.1.4. Cách tiến hành...........................................................................................15
4.1.5. Tính toán kết quả.......................................................................................17
5. KẾT LUẬN.............................................................................................................19
5.1. Kết luận về hàm lượng cafein..........................................................................19
5.2. Kết luận về trung tâm.......................................................................................19
TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................................21

iv
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1: Trung tâm kiểm định thuốc, mỹ phẩm, thực phẩm .....................................................................4
Hình 2: Sơ đồ cơ cấu tổ chức của trung tâm ............................................................................................5
Hình 3: CTCT của cafein .........................................................................................................................6
Hình 4: Quá trình tách sắc kí của các chất ...............................................................................................8
Hình 5: Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao MODEL-SHIMADZU-Nhật Bản......................................8
Hình 6: Bình chứa dung môi....................................................................................................................9
Hình 7: Bơm cao áp và bộ phận khử khí.................................................................................................9
Hình 8: Buồng mẫu ................................................................................................................................10
Hình 9: Buồng cột..................................................................................................................................10
Hình 10: Detector RF.............................................................................................................................11
Hình 11: Detector PDA..........................................................................................................................11
Hình 12: Mối quan hệ H = f(C) và S = f(C)...........................................................................................14
Hình 13: Sắc ký đồ của mẫu chuẩn........................................................................................................18
Hình 14: Sắc ký đồ của mẫu thử ............................................................................................................18
Hình 15: Mẫu cà phê chế phin 3 Trung Nguyên ....................................................................................19
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1: Kết quả xác định hàm lượng cafein trong 3 mẫu cà phê bột ...........................17
Bảng 2: Nồng độ của mẫu xác định bằng phương pháp HPLC ....................................18
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
HPLC Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
MP Mỹ phẩm
TP Thực phẩm

1
MỞ ĐẦU
Xã hội ngày càng phát triển thì vấn đề sức khỏe của con người ngày càng được
chú trọng. Chính vì thế mà các sản phẩm ảnh hưởng trực tiếp tới sức khỏe con người
ngày càng được quan tâm.
Cafein là thành phần phổ biến có trong hầu hết các loại thuốc giảm đau và trong
một số loại nước uống, nhất là chè và cà phê…[8]. Ngoài tác dụng làm giảm cảm giác
mệt mỏi và buồn ngủ, cafein còn có khả năng gây co mạch, làm giảm cường độ và thời
gian đau. Tuy nhiên việc sử dụng một cách tùy tiện hoặc lạm dụng quá mức các loại
dược phẩm, thức uống có chứa cafein có thể gây ra những triệu chứng, các tác dụng
phụ không mong muốn, gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người. [2]
Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, nhiều kỹ thuật phân tích
mới và hiện đại đã được áp dụng vào việc phân tích, xác định hàm lượng của các chất
hóa học nhằm kiểm soát chất lượng của các sản phẩm, đảm bảo an toàn và sức khỏe
của người sử dụng. Tại Việt Nam đã có các công trình nghiên cứu xác định thành phần
của caffein trong thực phẩm sử dụng phương pháp quang phổ UV-VIS, quang phổ đạo
hàm, HPLC,….
HPLC là một trong những phương pháp phân tích hiện đại, chính xác và nhanh
chóng.
Chính vì những lý do trên, trong chuyến thực tập thực tế này, em đã được
Trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc, Mỹ phẩm, Thực phẩm phân công tìm hiểu về đề tài
“XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CAFEIN TRONG CÀ PHÊ BỘT BẰNG PHƯƠNG
PHÁP SẮC kÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)”.

2
1. TRUNG TÂM KIỂM NGHIỆM THUỐC, MỸ PHẨM, THỰC PHẨM THỪA
THIÊN HUẾ [9]
1.1. Giới thiệu
- Tên chính thức : Trung tâm kiểm nghiệm thuốc, Mỹ phẩm, Thực phẩm Thừa
Thiên Huế
- Địa chỉ: 17 Trương Định, phường Vĩnh Ninh, TP Huế
- Năm thành lập: 1991
1.2. Chức năng và nhiệm vụ chính của Trung tâm:
1.2.1. Chức năng
Tham mưu giúp Giám đốc Sở Y tế trong việc kiểm tra, giám sát và quản lý chất
lượng các loại thuốc, MP và TP được sản xuất, tồn trữ, lưu hành và sử dụng tại địa
phương.
1.2.2. Nhiệm vụ
• Kiểm tra chất lượng thuốc, MP, TP.
- Kiểm nghiệm và nghiên cứu kiểm nghiệm, xác định chất lượng các loại thuốc,
MP, TP kể cả nguyên liệu, phụ liệu làm thuốc, MP, TP qua các khâu sản xuất, bảo
quản, lưu thông, sử dụng do các cơ sở sản xuất, kinh doanh dược phẩm, MP, TP gửi
tới hoặc lấy mẫu trên địa bàn tỉnh để kiểm tra, đánh giá chất lượng.
- Xây dựng kế hoạch triển khai thực hiện các nhiệm vụ chuyên môn, kỹ thuật về
kiểm tra, đánh giá chất lượng thuốc, MP, TP trên cơ sở quy định của pháp luật.
- Xây dựng phương pháp kiểm nghiệm, chỉ đạo và hướng dẫn về mặt chuyên
môn, nghiệp vụ kiểm nghiệm thuốc, MP, TP đối với các cơ sở sản xuất, kinh doanh
thuốc, MP, TP trên địa bàn tỉnh.
- Tham gia xây dựng, góp ý, thẩm định tiêu chuẩn kỹ thuật về mặt chất lượng
thuốc, MP, TP theo sự phân cấp và theo quy định của pháp luật.
- Báo cáo định kỳ về tình hình chất lượng thuốc, MP, TP trên địa bàn tỉnh với
Giám đốc Sở Y tế; tham mưu cho Giám đốc Sở Y tế trong việc giải quyết các trường
hợp khiếu nại và tranh chấp về chất lượng thuốc, MP, TP thuộc lĩnh vực chuyên môn
kiểm nghiệm; tham gia vào việc kiểm tra thực hiện các quy chế, chế độ chuyên môn
thuốc, MP, TP tại địa phương.
- Thực hiện các nhiệm vụ khác do Giám đốc Sở Y tế giao.

3
• Nghiên cứu khoa học
- Nghiên cứu phát triển các biện pháp nhằm nâng cao chất lượng thuốc, MP, TP
phục vụ bảo vệ, chăm sóc sức khỏe nhân dân.
- Nghiên cứu ứng dụng các tiến bộ khoa học - kỹ thuật trong lĩnh vực chuyên
ngành kiểm nghiệm để đánh giá chất lượng thuốc, MP, TP.
- Tham gia nghiên cứu xây dựng, thẩm định các chuyên luận Dược điển Việt
Nam và các tiêu chuẩn chất lượng thuốc, MP, TP trong phạm vi được phân công.
- Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn làm việc phục vụ cho công tác kiểm nghiệm tại
phòng thí nghiệm.
• Công tác đào tạo
- Tổ chức đào tạo lại, đào tạo nâng cao cho cán bộ kiểm nghiệm trong đơn vị về
quản lý, chuyên môn kỹ thuật đảm bảo chất lượng thuốc, MP, TP.
- Đào tạo, bồi dưỡng cán bộ chuyên khoa kiểm nghiệm và tham gia đào tạo cán
bộ dược ở địa phương.
• Hợp tác quốc tế
- Hợp tác nghiên cứu khoa học với các tổ chức quốc tế, các tổ chức chính phủ,
phi chính phủ, cá nhân ở nước ngoài theo quy định của pháp luật nhằm phục vụ công
tác nghiên cứu khoa học, ứng dụng các thành tựu khoa học vào lĩnh vực phân tích
kiểm nghiệm.
- Khai thác các nguồn viện trợ từ các tổ chức, cá nhân trong và ngoài nước để
đầu tư cho nghiên cứu khoa học, đào tạo cán bộ, phát triển đơn vị.
• Quản lý đơn vị
- Thực hiện quản lý công chức, viên chức, người lao động; chế độ chính sách
khen thưởng, kỷ luật đối với công chức, viên chức và quản lý tài chính, tài sản của đơn
vị theo quy định của pháp luật.

4
Hình 1: Trung tâm kiểm định thuốc, mỹ phẩm, thực phẩm
1.3. Giới thiệu về tình hình hoạt động và cơ cấu tổ chức
1.3.1. Tình hình hoạt động
Hiện nay, Trung tâm đã được trang bị hơn 50 loại thiết bị với khoảng 125 đầu
thiết bị phân tích để kiểm nghiệm các chỉ tiêu về thuốc, mỹ phẩm và thực phẩm gồm:
03 máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), 01 máy sắc ký lỏng siêu hiệu năng
(UPLC), 01 máy sắc ký lỏng khối phổ 2 lần (LC/MS/MS), 01 máy sắc ký khí (GC), 01
máy sắc ký khí khối phổ 1 lần (GC/M), 01 máy sắc ký khí khối phổ 2 lần
(GC/MS/MS), 01 máy điện di mao quản (CE), 02 máy quang phổ hấp thụ nguyên tử
(AAS), 02 máy quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-Vis), 01 máy quang phổ huỳnh
quang (FS), 01 máy quang phổ hồng ngoại (FT-IR),...
Hàng năm Trung tâm đã lấy 530 – 550 mẫu thuốc và mỹ phẩm, tiếp
nhận 500 – 600 mẫu thuốc, mỹ phẩm và 1600 – 1800 mẫu thực phẩm, thực phẩm
chức năng, mẫu khác,… để kiểm nghiệm đánh giá chất lượng.
1.3.2. Cơ cấu tổ chức

5
Hình 2: Sơ đồ cơ cấu tổ chức của trung tâm
1.3.3. Biên chế
- Biên chế của Trung tâm là biên chế sự nghiệp theo các quy định hiện hành của
Nhà nước và được Sở Y tế tỉnh Thừa Thiên Huế phân bố tổng số chỉ tiêu biên chế theo
quy định.
-Ngoài tổng số chỉ tiêu biên chế được phân bố theo quy định, tuỳ theo nhu cầu
công việc và khả năng tài chính củaTrung tâm, Giám đốc được ký kết hợp đồng lao
động theo quy định của bộ Luật Lao động hiện hành.
* Đội ngũ cán bộ: gồm có 28 CB biên chế, 01 CB hợp đồng theo NĐ 68 và 07
CB hợp đồng vụ việc, trong đó:
- Sau đại học: 13 cán bộ, gồm 01 tiến sĩ hóa phân tích, 08 thạc sĩ (01 thạc sĩ vi
sinh, 05 thạc sĩ hoá phân tích, 01 thạc sĩ Dược; 01 thạc sĩ công nghệ thực phẩm), 04
Dược sĩ Chuyên khoa I.
- Đại học: 11 cán bộ (06 dược sĩ đại học, 01 cử nhân kinh tế, 01 kỹ sư công
nghệ sinh học và 03 kỹ sư công nghệ thực phẩm).
- Cao đẳng: 02 cán bộ (01 cao đẳng dược, 01 cao đẳng công nghệ).
- Trung cấp: 06 cán bộ (05 dược sĩ trung học và 01 trung cấp thú y chăn nuôi).
- Khác: 04 cán bộ (01 lái xe, 02 bảo vệ, 01 tạp vụ).
2. GIỚI THIỆU VỀ ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
2.1. Cafein
Tên chung quốc tế: Caffein.

6
Các tên khác: trimethylxanthine, coffeine, theine, mateine, guaranine,
methyltheobromine và 1,3,7-trimethylxanthine [8].
Công thức phân tử: C8H10N4O2 .
Cafein được tách thành công lần đầu tiên vào năm 1820 bởi nhà hoá học người
Đức Friedlieb Ferdinand Runge [8].
Khối lượng mol của cafein là 194,2 g. Ở nhiệt độ bình thường một lít nước chỉ
hoà tan 20 g cafein, trong khi một lít nước sôi hoà tan tới 700 g. cafein cũng tan nhiều
trong chloroform, tuy nhiên lại chỉ tan một phần trong etanol. [8]
Nhóm dược lí: thuốc hướng tâm thần.
Dược lực: Cafein là thuốc thuộc dẫn xuất xanthin được chiết từ cà phê, ca cao hoặc
được tổng hợp từ axit uric. Cafein có tác dụng rõ trên thần kinh trung ương.
Tác dụng: [2]
- Lợi ích:
+ Trên thần kinh trung ương: cafein kích thích ưu tiên trên vỏ não làm giảm các
cảm giác mệt mỏi, buồn ngủ; làm tăng hưng phấn vỏ não, tăng cảm nhận giác quan, do
đó tăng khả năng làm việc và làm việc minh mẫn hơn.
+ Trên hệ tuần hoàn: cafein kích thích làm tim đập nhanh, mạnh tăng lưu lượng
tim và lưu lượng mạch vành.
+ Trên hệ hô hấp: kích thích trung tâm hô hấp, làm giãn phế quản và giãn mạch
phổi. Tác dụng này càng rõ khi trung tâm hô hấp bị ức chế.
+ Trên cơ trơn: thuốc có tác dụng làm giãn cơ trơn mạch máu, mạch vành, cơ trơn phế
quản và cơ trơn tiêu hóa.
+ Trên thận: thuốc làm giãn mạch thận, tăng sức lọc cầu thận, giảm tái hấp thu
Na+
nên có tác dụng lợi tiểu.
Hình 3: CTCT của cafein

7
- Tác hại:
+ Nếu sử dụng cafein liên tục và kéo dài thì sau giai đoạn hưng phấn là ức chế.
Với liều sử dụng cao, cafein tác dụng trên toàn bộ hệ thần kinh trung ương gây co giật.
+ Gây táo bón, tăng tiết dịch vị, có thể gây loét dạ dày, tá tràng
+ Gây ra các triệu chứng là mất ngủ, bồn chồn, kích thích nhẹ.
Nguyên nhân: do cafein ngăn cản phân hủy AMPv do ức chế cạnh tranh với
phosphodiesterase. Nồng độ AMPv tăng thúc đẩy các phản ứng làm tăng canxi nội
bào, tăng hoạt động của cơ tim, tăng chuyển hóa, tăng phân hủy lipid, tăng glucose
trong máu.
2.2. Các phương pháp phân tích cafein
Năm 2000, cafein trong huyết thanh người và thức uống coca được xác định
bằng phương pháp điện di mao quản. Giới hạn phát hiện của caffein thu được là 2,9.10
-4 mM và độ lệch chuẩn của thời gian điện di và diện tích pic thu được của caffein lần
lượt là 0,68% và 2,3% [1].
Năm 2016, xác định đồng thời Paracetamol và cafein trong dược phẩm bằng
phương pháp trắc quang kết hợp thuật toán lọc Kalman bởi Trần Thúc Bình, Nguyễn
Thị Quỳnh Trang, Châu Viết Thạch [3].
Năm 2000, xác định caffein trong các loại nước uống như cola, cà phê và
Trà bằng phương pháp phổ đạo hàm lấy phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao được
sử dụng làm phương pháp đối chiếu [1].
Trong các phương pháp nghiên cứu đó, phương pháp HPLC được xem là
phương pháp phổ biến nhất bởi độ nhạy và độ chính xác cao được đưa vào TCVN
TCVN 9723:2013.
3. TỔNG QUAN LÝ THUYẾT VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG
CAO (HPLC)
3.1. Giới thiệu về phương pháp (HPLC)
Bản chất của phân tích sắc ký: cho hỗn hợp chất hấp phụ lên pha tĩnh và giải
hấp phụ nhờ các pha động do các cấu tử chất phân tích có ái lực khác nhau với pha
tĩnh, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau.

8
Hình 4: Quá trình tách sắc kí của các chất [2]
HPLC là chữ viết tắt 4 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography ra đời năm 1967-1968
trên cơ sở phương pháp sắc ký cột cổ điển. Phương pháp này ngày càng được sử dụng
rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do:
- Độ nhạy, chính xác cao: Phân tích cấu tử khó bay hơi có khả năng hòa tan trong
loại dung môi phổ biến để làm pha động như H2O, MeOH, Acetonitril (ACN)…
- Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, trong nhiều lĩnh vự nghiên
cứu cả trong học thuật và trong công nghệ. Phân tích các hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc
kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, môi
trường…
3.2. Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống máy HPLC [4] [5]
Hình 5: Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao MODEL-SHIMADZU-Nhật Bản
Hệ thống trang bị của máy HPLC gồm các bộ phận cơ bản như sau:
Thời gian
Pha động

9
a. Bình chứa dung môi (pha động)
Gồm 4 lọ dựng dung môi 1lít. Chương trình
Gradient dung môi: trộn 4 dòng dung môi với
tổng tỷ lệ của 4 đường là 100% ở áp suất thấp, tỉ
lệ biến đổi theo chương trình đã định, tạo
chương trình dung môi bằng việc sử dụng van tỉ
lệ ở tốc độ cao.
b. Bộ phận khử khí
Là bộ phận này nằm gần khu vực bơm cao áp, có tác dụng loại bỏ các bọt nhỏ
sót lại trong pha động để tránh các hiện tượng:
- Biến dạng các peak, nhiễu đường nền và xuất hiện các peak lạ.
- Tỷ lệ pha động của các đường dung môi không đúng làm cho thời gian lưu của
peak thay đổi.
- Ảnh hưởng đến áp suất và hoạt động của cả hệ thống HPLC.
➢ Kết quả phân tích sai.
c. Bơm cao áp
Là bộ phận quan trọng dùng để
bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia
tách sắc ký. Bơm phải tạo được áp suất cao
khỏang >=400 bar và tạo dòng liên tục. Lưu
lượng bơm từ 0,0001 đến 10ml/phút. Loại bơm:
bơm dung môi kiểu parallet type double plunger
(bơm piston).
Hình 6: Bình chứa dung môi
Hình 7: Bơm cao áp và bộ phận khử khí

10
d. Bộ phận tiêm mẫu
Nằm trong buồng mẫu. Để đưa 1 lượng mẫu
với thể tích xác định vào pha động.
Có 2 cách đưa mẫu vào cột: bằng tiêm mẫu thủ
công và tiêm mẫu tự động (autosamper).
e. Cột sắc kí (cột tách)
- Là cột chứa pha tĩnh, trái tim của quá trình tách
sắc kí. Nó là một trong những yếu tố quyết định hiệu quả
sự tách sắc kí của một hỗn hợp chất mẫu.
- Gồm cột phân tích và cột bảo vệ.
+ Cột phân tích: tách các cấu tử cần phân tích. Cột
phântích đặt trong buồng chứa cột nhằm ổn định nhiệt độ.
+ Cột bảo vệ: bảo vệ cột phân tích khỏi bị hư hỏng do
nhiễm bụi bẩn hoặc do ăn mòn bởi hóa chất. Cột bảo vệ
rất ngắn, rẻ tiền.
- Cột tách có nhiều cỡ khác nhau, tuỳ thuộc vào mức độ sắc kí. Chất nhồi cột là
Silicagen (pha thuận) hoặc Silicagel đã được Silan hóa hoặc được bao một lớp mỏng
hữu cơ (pha đảo).
+ Cột phân tích C18 kích thước 4.6 × 250 mm, 5µm và bảo vệ cột.
+ Cột phân tích C8 kích thước 4.6 × 250 mm, 5µm và bảo vệ cột.
- Đối với một số phương pháp phân tích đòi hỏi phải có nhiệt độ cao hoặc thấp
hơn nhiệt độ phòng thì cột được đặt trong bộ phận điều nhiệt (Oven column).
f. Đầu dò (detector)
Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên
sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng. Tùy theo tính chất của các chất phân tích
mà người ta lựa chọn lọai đầu dò phù hợp.
Hình 8: Buồng mẫu
Hình 9: Buồng cột

11
- Detector RF: Detector huỳnh quang để
phát hiện các chất hữu cơ phát huỳnh quang tự
nhiên cũng như các dẫn chất có huỳnh quang. Là
loại Detector có độ chọn lọc cao nhất.
- Detector PDA: Detector quang phổ tử
ngoại khả kiến ( UV - VIS): 190 -900 nm để phát
hiện các chất hấp thụ quang. Đây là loại thông
dụng nhất.
g. Hệ thống máy tính có phần mềm ghi nhận tín hiệu, xử lý dữ liệu và điều khiển
hệ thống.
Tín hiệu đo được ghi dưới dạng các peak của các chất bởi máy tự ghi(recorder),
rồi đến bộ tích phân kế (intergrator), sau đó máy tính và máy in kèm theo để xử lý kết
quả và in kết quả.
3.3. Nguyên tắc hoạt động của phương pháp HPLC
- 4 chai đựng dung môi tinh khiết sẽ đi qua 4 kênh A, B, C, D. Ở đầu của mỗi
kênh có một đầu lọc để lọc lại 1 lần nữa, (đầu lọc này sử dụng một thời gian có thể
tháo ra vệ sinh bằng xà phòng hoặc acid và máy siêu âm). Lượng dung môi và tỉ lệ đã
lập trình trên máy tính sẽ đi vào đầu lọc và hệ thống ống dẫn và đến bộ phận khử khí.
Sau khi đuổi hết khí, 4 dòng này sẽ được nhập lại thành 1 dòng và đi vào bơm cao áp.
- Sau khi được gia tăng áp suất, dung môi đi qua 1 ngã 3, sẽ có 2 chế độ:
Pump: dòng dung môi sẽ được dẫn đi vào cột sắc kí.
Purge: dòng dung môi sẽ được dẫn đi ra ống thải. Đây là chế độ dành cho lần chạy
đầu, mục đích để đánh đuổi bọt khí trong lòng ống ở phía trước cột sắc kí ra (nếu bọt
Hình 10: Detector RF
Hình 11: Detector PDA

12
khí chạy đến cột sẽ dẫn đến gia tăng áp suất đột ngột, lúc đó máy sẽ dừng và không
tiến hành chạy được).
- Sau đó, dung môi sẽ đi vào giao giữa tiêm mẫu và pha động.
- Mẫu được bơm với một thể tích nhất định(áp suất thường) tách khỏi hệ pha
động (áp suất cao). Lúc đó, pha động chảy trực tiếp từ bơm vào cột (áp suất cao). Khi
van xoay đến vị trí INJECT, vòng chứa mẫu trở thành bộ phận trong dòng chảy của
pha động và mẫu sẽ được đưa đến cột. Cho dung môi (pha động) nạp vào cột bằng
pittông. Quá trình sắc ký bắt đầu xảy ra.
- Chất phân tích đã được rửa giải sẽ đi ra theo đầu 1 ống nhựa và đi vào hệ thống
detector để tiến hành dò tín hiệu. Detector phân tích xong, chất phân tích sẽ đi ra theo1
ống nhựa khác gọi là sợi thải đi vào bình hứng.
- Tín hiệu do detector đọc được sẽ được ghi dưới dạng các peak của các chất bởi
máy tự ghi (recorder), rồi đến bộ tích phân kế (intergrator), sau đó máy tính và máy in
kèm theo để xử lý kết quả và in kết quả.
3.4. Các đại lượng quan trọng trên sắc ký đồ
3.4.1. Thời gian lưu (tR)
Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ khi bơm mẫu vào cột cho đến khi
chất đó ra khỏi cột. Trong cùng điều kiện sắc ký, các chất khác nhau thì thời gian lưu
sẽ khác nhau.Vì vậy thời gian lưu là đại lượng để định tính.
Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố :
+ Bản chất sắc ký của pha tĩnh.
+ Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động.
+ Cấu tạo và bản chất của chất phân tích.
+ Trong một số trường hợp thời gian lưu còn phụ thuộc vào pH của pha động.
Nếu tR nhỏ quá thì sự tách kém ,còn nếu tR quá lớn thì peak bị doãng và độ lặp
lại của Peak rất kém, thời gian phân tích rất dài, đặc biệt là hao tốn dung môi, hoá chất,
độ chính xác của phép phân tích kém.
3.4.2. Số đĩa lỹ thuyết (N)
- Nó được xem như là một lớp pha tĩnh có chiều cao là H (đoạn đường mà cấu tử
đi được khi thực hiện 1 cân bằng (1 đĩa lý thuyết)). Tất nhiên lớp này có tính chất động

13
tức là một khu vực của hệ phân tách mà trong đó một cân bằng nhiệt động học được
thiết lập giữa nồng độ trung bình của chất tan trong pha tĩnh và pha động .
+ N càng lớn khả năng tách càng tốt, các peak sắc ký càng hẹp và nhọn ( tốt).
+ N nhỏ khả năng tách kém, sẽ cho các peak tù và xấu ( không tốt).
3.4.3. Hệ số không đối xứng T
Peak dạng đối xứng hình Gauss trên thực tế khó đạt được vì vậy phải quan tâm
đến hệ số không đối xứng T. Vì vậy phép định lượng cần phải thay đổi các điều kiện
sắc ký để làm cho Peak cân đối hơn theo các cách sau :
+ Làm giảm thể tích chết tức là đoạn nối từ cột đến Detector .
+ Thay đổi thành phần pha động sao cho khả năng rửa giải tăng lên.
+ Giảm bớt lượng mẫu đưa vào cột bằng cách pha loãng mẫu hay giảm thể tích
tiêm mẫu .
3.4.4. Diện tích peak (S), chiều cao peak (h)
Trong quá trình sắc ký, tín hiệu đo được của quá trình sắc ký hoặc là chiều cao
của peak hoặc là diện tích của peak sắc ký.
Trong những điều kiện sắc ký xác định, thì 2 đại lượng này luôn có quan hệ phụ
thuộc vào nồng độ của chất ở trong mẫu. Mối quan hệ này có thể được biểu thị bằng 2
phương trình sau đây:
Theo chiều cao H: H = k.c Hay theo diện tích S: S = k.c
Ở đây : H và S là chiều cao và diện tích của peak sắc ký;
C là nồng độ của chất trong mẫu;
k là hằng số, nó được xác định bởi các điều kiện sắc ký đã chọn và bản
chất của chất phân tích.
3.5. Định lượng bằng HPLC
3.5.1. Phương pháp so chuẩn
Hàm lượng cafein wx được biểu thị phần trăm khối lượng, tương đương với
gam trên 100g cà phê, theo công thức:
wx =
𝐴 𝑋×𝜌 𝑐×𝑉×100
𝐴 𝑐×𝑚 𝑠
hoặc w’x =
𝐴 𝑥×𝜌 𝑐×𝑉×100
𝐴 𝑐×𝑚 𝑠×𝑤 𝑑
×100 =
𝐴 𝑥×𝜌 𝑐×2500
𝐴 𝑐×𝑚 𝑠×𝑤 𝑑
Trong đó:

14
Ac là diện tích peak cafein của dung dịch chuẩn (đvdt).
Ax là diện tích peak cafein của dung dịch (đvdt).
ms là khối lượng phần mẫu thử (g).
V là thể tích dung dịch mẫu chiết được (l).
ρc là nồng độ khối lượng của dung dịch chuẩn cafein (g/l).
wd là hàm lượng chất khô của mẫu ( gam trên 100 gam), được xác định được
qua việc xác định độ ẩm ở mục (4.1.4.1).
CHÚ THÍCH: chiều cao peak có thể được sử dụng để thay thế cho diện tích
peak. Nếu sử dụng nhiều hơn 1 chuẩn hiệu chuẩn thì dựng đường chuẩn tuyến tính đối
với các nồng độ chuẩn cafein, để thu được độ dốc và giá trị chắn. Sử dụng đường
chuẩn này để tính nồng độ cafein trong mẫu.
Lấy kết quả là giá trị trung bình của 2 lần xác định tiến hành dưới các điều kiện
lặp lại.
3.5.2. Phương pháp đường chuẩn
Người ta dựa theo hai phương trình cơ bản sau đây về mối quan hệ giữa pic sắc
kí (diện tích, hay chiều cao) của chất với nồng độ C của chúng được bơm vào cột tách.
H = a.C + b Hoặc S = a.C+ b
Trong đó:
+ H : Chiều cao peak sắc kí của chất.
+ S : Diện tích peak sắc kí của chất.
Hình 12: Mối quan hệ H = f(C) và S = f(C) [2]
Để phân tích định lượng các chất theo kỹ thuật HPLC, chúng ta có thể dùng
một trong hai phương pháp so chuẩn và phương pháp đường chuẩn.Việc chọn phương
pháp nào là tuỳ thuộc vào loại mẫu phân tích và hàm lượng chất phân tích.

15
4. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CAFEIN TRONG CÀ PHÊ BỘT BẰNG
PHƯƠNG PHÁP HPLC
4.1.Xác định hàm lượng Cafein trong Cà phê bột bằng phương pháp HPLC trong
thực nghiệm.
4.1.1. Nguyên lý:
Chiết cafein từ mẫu thử bằng nước ở 90ºC với sự có mặt của magie oxid. Sau
đó, hàm lượng cafein trong dịch chiết được xác định bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao
(HPLC)-MODEL-SHIMADZU-NHẬT BẢN trên cột RP-18, dùng phương pháp rửa
giải đẳng dòng, sử dụng detector UV tại bước sóng λ=272nm.
4.1.2. Thiết bị và dụng cụ:
- Hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC-MODEL-SHIMADZU-NHẬT BẢN
(bơm cao áp, bộ bơm mẫu tự động, detector UV, cột sắc kí pha đảo C18).
- Vial để đựng mẫu chạy máy.
- Màng lọc 0,45µm.
- Cân phân tích 4 số.
- Dụng cụ đồng nhất mẫu.
- Bếp cách thủy có điều nhiệt.
- pipet, micro pipet, bình nón, bình định mức.
4.1.3. Hóa chất và thuốc thử
- Mẫu cà phê bột: cà phê chế phin 3 Trung Nguyên.
- Nước: yêu cầu loại 1 của TCVN 4851.
- Metanol: loại dùng cho HPLC.
- MgO: loại nặng, có chất lượng cao.
- Cafein chuẩn dạng khan tinh khiết (99%).
- Pha động: methanol trong nước ( tỉ lệ linh hoạt tùy vào quá trình khảo sát).
4.1.4. Cách tiến hành
4.1.4.1. Phép xác định tùy chọn chất khô của cà phê

16
- Tỷ lệ hao khối lượng được tính bằng phần trăm khối lượng, theo công thức sau:
X=
(𝑚1−𝑚2)×100
𝑚1−𝑚0
Trong đó
m0: khối lượng hộp cân và nắp đậy sau sấy, tính bằng g.
m1: khối lượng hộp cân, lượng mẫu cân và nắp đậy trước khi sấy, tính bằng g.
m2: khối lượng hộp cân, lượng mẫu cân và nắp đậy sau khi sấy, tính bằng g.
Lấy kết quả trung bình số học của hai lần xác định.
4.1.4.2. Pha dung dịch mẫu chuẩn
Ta có 100ml dung dịch chuẩn gốc cafein 1000ppm.
Ta có 100ml dung dịch chuẩn pha loãng 20 lần với nồng độ là 50ppm.
4.1.4.3. Xử lý mẫu thử
- Lẫy mẫu: mẫu cà phê bột đựng trong bao bì không hư hỏng, cần tối thiếu 50g
sản phẩm. không cần nghiền, xay.
*MgO có mục đích loại tạp chất trong dung dịch giúp cho sắc ký đồ ổn định hơn.
Việc sử dụng MgO rất quan trọng đối với tuổi thọ của cột phân tích. Lượng MgO được
sử dụng tùy thuộc vào thiết bị và dạng sản phẩm cà phê.
4.1.4.4. Khảo sát điều kiện tối ưu
a. Chọn thể tích vòng mẫu

17
Vòng mẫu có thể tích càng nhỏ càng tốt để tạo nên peak có độ sắc nét cao, tránh
doãng pic. Tuy nhiên, phải lưu ý đến giới hạn phát hiện của detector. Trong phân tích
HPLC sử dụng các vòng mẫu 10, 20, 30, 50 và 100 µl.
b. Chọn cột
Cafein là chất ít phân cực, nên ta chọn các loại cột RP – HPLC. Trên thị trường
có cột sắc kí pha đảo C8 và C18 .
c. Khảo sát thành phần pha động
Khi tỷ lệ thành phần pha động thay đổi thì lực rửa giải của dung môi pha động
thay đổi, nghĩa là làm thay đổi thời gian lưu của các chất phân tích.
Theo TCVN 9723:2013, thành phần pha động là 24% phần thể tích methanol
trong nước. Tuy nhiên, trong quá trình chạy, tỉ lệ này có thể thay đổi để ra peak như
mong muốn.
d. Khảo sát tốc độ dòng pha động
Tốc độ dòng pha động càng lớn, thời gian lưu càng bé.
Theo TCVN 9723:2013, tốc độ dòng pha động: 1,0 ml/phút. Tuy nhiên, trong
quá trình chạy máy, ta có thể giảm xuống 0,6 ml/phút.
➢ Qua quá trình khảo sát, các điều kiện được xem như tối ưu nhất:
- Thời gian chạy mẫu 20 phút. - Thể tích vòng mẫu: 20µl.
- Cột: RP-C18. - Thành phần pha động: 60%
methanol.
- Tốc độ dòng pha động: 0,6 ml/phút.
4.1.5. Tính toán kết quả
4.1.5.1. Kết quả
Tiến hành xác định hàm lượng cafein trong mẫu cà phê bột, tiến hành đo 2 lần
để lấy giá trị trung bình. Kết quả thu được ở bảng 1.
Bảng 1: Kết quả xác định hàm lượng cafein trong 3 mẫu cà phê bột
Diện tích Khối lượng cân TR Độ pha loãng
Chuẩn 50ppm 894937 0,1185 6,236 2000
Mẫu 1309542 0,5314 6,227 100
1358885 0,5412 6,229 100

18
4.1.5.2. Tính toán
Phương pháp sử dụng trong lần thực nghiệm này là phương pháp so chuẩn, nên
áp dụng công thức trong mục (3.5.1). Tuy nhiên, khi cân mẫu chuẩn, sẽ không cân
được chình chính xác như quy trình và hàm lượng mẫu chuẩn không nguyên chất
100% , nên công thức tính hàm lượng sẽ được biến đổi thành:
𝐶(
𝑚𝑔
𝑘𝑔
) =
𝑆𝑡ℎ
𝑆𝑐ℎ
×
𝑚 𝑐ℎ
𝑚 𝑡ℎ
×
𝐷𝑃𝐿 𝑡ℎ
𝐷𝑃𝐿 𝑐ℎ
×𝐶𝑐ℎ
- 𝐷𝑃𝐿 𝑡ℎ: độ pha loãng của mẫu thử.
- 𝐷𝑃𝐿 𝑐ℎ: độ pha loãng của mẫu chuẩn.
- 𝐶𝑐ℎ: hàm lượng của mẫu chuẩn (98%).
Từ công thức trên, ta rút ra được bảng kết quả:
Bảng 2: Nồng độ của mẫu xác định bằng phương pháp HPLC
Mẫu Lần 1 Lần 2 Trung bình
Hàm lượng (ppm) 1,598895 1,629097 1,613996
Hình 13: Sắc ký đồ của mẫu chuẩn
Hình 14: Sắc ký đồ của mẫu thử

19
5. KẾT LUẬN
5.1. Kết luận về hàm lượng cafein
Mẫu cà phê bột mà ta phân tích là cà phê
chế phin 3 Trung Nguyên có hàm lượng cafein ghi
trên bao bì là 1,7% khối lượng. bằng phương pháp
phân tích HPLC, xác định được hàm lượng cafein
1,613996% khối lượng.
Theo TCVN 5251-2007: cafein trong cà phê
bột không nhỏ hơn 1% khối lượng. Vậy, cà phê chế
phin 3 trung nguyên đạt chất lượng TCVN.
Phương pháp phân tích HPLC là một phương pháp có độ chính xác cao, được
trung tâm kiểm định thuốc, mỹ phẩm, thực phẩm thẩm định lại và sử dụng để xác định
hàm lượng cafein.
5.2. Kết luận về trung tâm
Thời gian em thực tập tại Trung tâm tuy không dài nhưng cũng đủ cho em gặt
hái được nhiều kiến thức và kinh nghiệm thực tế. Bên cạnh đó, em cũng hiểu rõ hơn về
nơi mà em thực tập thực tế.
Trung tâm được trang bị nhiều thiết bị, máy móc hiện đại phục vụ cho việc
phân tích thuốc, mỹ phẩm, thực phẩm. Máy móc được bảo quản trong điều kiện tốt
nhất. Các khâu chuẩn bị mẫu, vệ sinh dụng cụ thí nghiệm được tiến hành kỹ lưỡng.
mẫu thử nghiệm và chờ thử nghiệm được bảo quản kỹ càng.
Công việc kiểm định chất lượng luôn được đảm bảo trung thực, chính xác,
khách quan. Hầu hết các quy trình đều từ TCVN và đã qua thẩm định. Trung tâm có hệ
thống chứa chất thải rắn, lỏng, khí để xử lý các chất thải theo quy định.
Đối với nhiệm vụ của trung tâm, em thấy rằng, vai trò của một cử nhân hóa là
vô cùng quan trọng. Hay nói cách khác, kiểm định chất lượng sản phẩm là một trong
những công việc chính mà một cử nhân hóa học đảm điệm.
Một cử nhân hóa có thể đảm nhiệm nhiều công viêc, chức vụ. Trong đó, công
việc chính đó là kiểm nghiệm viên.
Hình 15: Mẫu cà phê chế phin 3
Trung Nguyên

20
Trong những yêu cầu cơ bản khi Trung tâm tuyển dụng như: ngoại ngữ, chuyên
môn, tin học, các kỹ năng như giao tiếp…theo em, quan trọng nhất đó chính là chuyên
môn.
Một kỹ sư/ cử nhân hóa có thể nhận được mức lương trung bình 5 triệu đồng.
trong quá trình công tác, có thể tham gia nghiên cứu, được bồi dưỡng kỹ năng và tham
gia hợp tác nghiên cứu khoa học với các tổ chức quốc tế…
Đối với em, để ứng tuyển vào Trung tâm, em cần phải trau dồi thêm kiến thức
chuyên môn và kỹ năng sử dụng máy tính.
Nếu được nhận vào, căn cứ vào yêu cầu của Trung tâm, khả năng đáp ứng của
bản than và mức sống tại địa phương, em nghĩ em có thể nhận được mức lương tháng
trong khoảng 5-7 triệu đồng.

21
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng việt
[1]. TCVN 9723:2013. Cà phê và sản phẩm cà phê-Xác định hàm lượng cafein bằng
sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPCL)-Phương pháp chuẩn.
[2]. Nguyễn Thị Ngọc Trinh (2013). Phân tích đồng thời Paracetamol và cafein trong
dược phẩm bằng phương pháp HPLC, Khóa luận tốt nghiệp, Khoa hóa học, trường đại
học Sư phạm TP. Hồ Chí Minh.
[3]. Trần Thúc Bình , Nguyễn Thị Quỳnh Trang, Châu Viết Thạch (2016). Xác định
đồng thời paracetamol và cafeine trong dược phẩm bằng phương pháp trắc quang kết
hợp thuật toán lọc Kalman, Tạp chí phân tích Hóa, Lý và Sinh học.
Tài liệu internet
[4]. https://www.slideshare.net/phangtimi/sc-k-lng-trong-ha-phn-tch-mi-trng, update
4.00 pm, 02/07/2017.
[5]. https://nhatdangco.blogspot.com/2016/03/may-sac-ky-long-hieu-nang-cao-
hplc_57.html, 10.00 am, 04/07/2017.
[6]. https://trinhhaithang.wordpress.com/2016/09/08/sac-ky-pha-dao/, 9.00 am
04/07/2017.
[7]. https://hitachichromaster.wordpress.com/, 9.00 pm, 06/07/2017
[8]. https://vi.wikipedia.org/wiki/Caffein#L.E1.BB.8Bch_s.E1.BB.AD, 3.00 pm,
24/8/2017.
[9]. http://hueqc.thuathienhue.gov.vn/?gd=1&cn=83&cd=10, 4.00 pm,24/8/2017.

Báo cáo thực tập (2)

More Related Content

What's hot (20)

Similar to Báo cáo thực tập (2) (20)

Recently uploaded (20)

Báo cáo thực tập (2)