Download to read offline
![CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về aflatoxin
1.1.1. Giới thiệu về aflatoxin
Aflatoxin được phát hiện và phân lập lần đầu tiên vào năm 1960 sau sự
kiện Bệnh Gà tây X ở Anh làm chết hơn 100.000 con gà tây. Những con gà
tây này bị hoại tử gan sau khi được cho ăn lạc mốc và aflatoxin được xác định
là nguyên nhân gây bệnh [15,25].
Aflatoxin là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp được sản xuất bởi một vài
loại vi nấm, đặc biệt là nấm Aspergillus flavus và Aspergillus paraciticus.
Nấm mốc có thể phát triển và sinh aflatoxin trước và sau khi thu hoạch, khi
bảo quản cũng như chế biến. Nhiều nông sản có thể bị nhiễm aflatoxin như
ngũ cốc, lúa gạo; các loại hạt có dầu như hạt đậu, hạt hướng dương, bông; các
loại gia vị như ớt , hạt tiêu, nghệ, gừng; hạnh nhân, quả óc chó và sữa cùng
các sản phẩm từ sữa (bơ, pho mát...) [10,20].
Aflatoxin là một nhóm chất gồm các chất có cấu tạo tương tự nhau và đều
là dẫn chất của difuranocoumarin, được tổng hợp nhờ con đường polyketide.
Ngày nay, người ta đã xác định được khoảng 20 loại aflatoxin trong đó 6 loại
aflatoxin quan trọng nhất lần lượt là B1, B2, M1, M2, G1 và G2
[27]. Aflatoxin B1là loại aflatoxin độc nhất và phổ biến nhất, chiếm 60-80%
tổng số aflatoxin nhiễm độc trong lương thực, thực phẩm. Thông thường, nếu
không có aflatoxin B1 thì cũng sẽ không có AFB2, AFG1 và AFG2 [10,14].
1.1.2. Tính chất hóa lý
Aflatoxin hòa tan trong dung môi phân cực nhẹ như cloroform,
methanol, dimethyl sulfoxid. Độ tan của aflatoxin trong nước vào khoảng 10–
20 mg/l. Dung dịch aflatoxin trong dung môi cloroform hay benzen có thể
đưuọc trong nhiều năm nếu bảo quản ở điều kiện lạnh và tối [3].
2](https://image.slidesharecdn.com/khoalunxydngphngphpnhlngaflatoxintrongdcliubnglc-msms-230412091444-36aac180/75/Khoa-Lu-n-Xay-D-ng-Ph-ng-Phap-D-nh-L-ng-Aflatoxin-Trong-D-c-Li-u-B-ng-Lc-MsMs-12-2048.jpg)
![Ở nhiệt độ đun nấu thông thường không thể phân hủy được aflatoxin,
nhưng dưới ánh sáng tử ngoại các aflatoxin bị phân hủy. Trong công thức c ấu
tạo có vòng lacton nội phân tử, nên các aflatoxin dễ bị phân hủy bởi base
mạnh và nếu tiếp tục acid hóa nhẹ thì aflatoxin ban đầu được tái tạ o [3].
Các aflatoxin phát huỳnh quang rất mạnh, dựa vào tính chất này ta có
thể phát hiện chúng ở nồng độ rất thấp (trên sắc ký đồ lớp mỏng có thể phát
hiện với lượng chất khoảng 0,5ng hay nhỏ hơn). Đây chính là cơ sở hóa lý
cho việc phát hiện và định lượng các hợp chất này [3].
3](https://image.slidesharecdn.com/khoalunxydngphngphpnhlngaflatoxintrongdcliubnglc-msms-230412091444-36aac180/75/Khoa-Lu-n-Xay-D-ng-Ph-ng-Phap-D-nh-L-ng-Aflatoxin-Trong-D-c-Li-u-B-ng-Lc-MsMs-13-2048.jpg)
![Bảng 1. 1. Tính chất của một vài aflatoxin
STT
Loại
CTPT
TLPT
Tính chất CTCT TLTK
aflatoxin (đvC)
- Nhiệt độ nóng chảy 268-269 o
C
- Huỳnh quang màu xanh da trời.
1 AFB1 C17H12O6 312
- [α]D: -480o
(0,1M/dimethyl
[22]
formamid)
- Hấp thụ UV cực đại trong môi
trường ethanol: 223; 265; 362 nm.
- Nhiệt độ nóng chảy 286-289 o
C
- Huỳnh quang màu xanh da trời.
2 AFB2 C17H14O6 314 - [α]D: -492o
(0,1M/cloroform) [22]
- Hấp thụ UV cực đại trong môi
trường ethanol: 265; 363 nm.
4](https://image.slidesharecdn.com/khoalunxydngphngphpnhlngaflatoxintrongdcliubnglc-msms-230412091444-36aac180/75/Khoa-Lu-n-Xay-D-ng-Ph-ng-Phap-D-nh-L-ng-Aflatoxin-Trong-D-c-Li-u-B-ng-Lc-MsMs-14-2048.jpg)
![- Nhiệt độ nóng chảy 244-246 o
C
- Huỳnh quang màu xanh lá cây.
3 AFG1 C17H12O7 328
- [α]D: -556o
(0,1M/cloroform)
- Hấp thụ UV cực đại trong môi
trường ethanol: 243; 257; 264;
362nm.
- Nhiệt độ nóng chảy 237- 240 o
C
- Huỳnh quang màu xanh lá cây.
4 AFG2 C17H14O7 330 - [α]D: -430o
(0,084M/cloroform)
- Hấp thụ UV cực đại trong môi
trường ethanol: 265; 363 nm.
- Nhiệt độ nóng chảy 299 o
C
- Huỳnh quang màu xanh tím.
5 AFM1 C17H12O8 344
- [α]D: -280o
(0,1M/dimethyl
formamid)
- Hấp thụ UV cực đại trong môi
trường ethanol: 266; 265; 357 nm.
5
[22]
[22]
[22]](https://image.slidesharecdn.com/khoalunxydngphngphpnhlngaflatoxintrongdcliubnglc-msms-230412091444-36aac180/75/Khoa-Lu-n-Xay-D-ng-Ph-ng-Phap-D-nh-L-ng-Aflatoxin-Trong-D-c-Li-u-B-ng-Lc-MsMs-15-2048.jpg)
![6 AFM2 C17H14O8 346
- Nhiệt độ nóng chảy 293 o
C
- Huỳnh quang màu tím.
- Hấp thụ UV cực đại trong môi
trường ethanol: 221; 264; 357 nm.
[22]
6](https://image.slidesharecdn.com/khoalunxydngphngphpnhlngaflatoxintrongdcliubnglc-msms-230412091444-36aac180/75/Khoa-Lu-n-Xay-D-ng-Ph-ng-Phap-D-nh-L-ng-Aflatoxin-Trong-D-c-Li-u-B-ng-Lc-MsMs-16-2048.jpg)
![1.1.3. Điều kiện sinh aflatoxin
Chủng giống:
Các loài nấm mốc có thể sinh aflatoxin gồm các loài thuộc chi
Aspergillus, thuộc họ nấm cúc: A. flavus, A. arachidicola, A. bombycis, A.
minisclerotigenes, A. nomius, A. ochraceoroseus, A. parasiticus, A.
pseudotamarii, A. rambellii, trong đó A. flavus và A. parasiticus là hai chủng
nấm chủ yếu thường gặp sinh aflatoxin B1 [12]. Hầu hết các chủng nấm
Aspergillus sinh trưởng tốt trong điều kiện nhiệt độ 30-35o
C và độ ẩm không
khí trên 55% trong khoảng pH rộng từ 3-10 trên những cơ chất giàu năng
lượng dạng tinh bột [6]. Tuy nhiên, sự có mặ t của chủng nấm mốc sinh
aflatoxin không đồng nghĩa với nhiễm aflatoxin do sự tổng hợp aflatoxin còn
phụ thuộc vào nhiều yếu tố vật lý, hóa học và sinh học.
Điều kiện môi trường và cơ chất:
Các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm
mốc và sự hình thành aflatoxin bao gồm: năng lượng (thường dưới dạng tinh
bột), vitamin, acid béo, amino acid và chất khoáng, đặc biệt cần có mặt Kẽm
(Zn). Vì thế, nhiễm độc aflatoxin thường có trong những sản phẩm nhiều tinh
bột, các hạt có dầu như hạt bông, đậu nành tỷ lệ nhiễm ít hơn [14].
Nhiệt độ và độ ẩm cũng ảnh hưởng đến sự tạo thành aflatoxin. Nhiệt độ
tối thiểu và tối đa cho tổng hợp aflatoxin theo nghiên cứu lần lượt là 12o
C và
42o
C. Nhiệt độ tối ưu để hình thành aflatoxin là 25-35o
C, nhiệt độ tối ưu để
tổng hợ p aflatoxin B1 là 24-28o
C. Độ ẩm cần thiết cho tổng hợp aflatoxin của
nấm mốc là trên 62%, hàm ẩm nông sản cho tổng hợp aflatoxin tối đa ở nông
sản nhiều tinh bột là 18% và trong quả, hạt có dầu là 9-10% [10,14,21].
Như vậy, khí hậu và điều kiện bảo quản ảnh hưởng rất lớn đến sự
nhiễm độc aflatoxin trong sản phẩm. Các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới
trong đó có Việt nam có khí hậu nóng ẩm, nhiệt độ cao, mưa nhiều phần lớn
7](https://image.slidesharecdn.com/khoalunxydngphngphpnhlngaflatoxintrongdcliubnglc-msms-230412091444-36aac180/75/Khoa-Lu-n-Xay-D-ng-Ph-ng-Phap-D-nh-L-ng-Aflatoxin-Trong-D-c-Li-u-B-ng-Lc-MsMs-17-2048.jpg)
![thời gian trong năm, thường có sản phẩm bị nhiễm aflatoxin nhiều hơn so với
các nước ôn đới. Các nước đang phát triển như ở khu vực Đông Nam Á, Châu
Phi...chưa có nền nông nghiệp hiện đại hóa với những điều kiện trồng trọt và
bảo quản chưa đạt tiêu chuẩn làm tăng nguy cơ xuất hiện aflatoxin trong các
sản phẩm nông nghiệp nói chung và dược liệu nói riêng.
1.1.4. Cơ chế gây bệnh của aflatoxin
Trong số các loại aflatoxin thì AFB1 là loại độc nhất và phổ biến nhất,
chiếm 60-80% tổng số aflatoxin nhiễm độc trong lương thực, thực phẩm.
AFB1 được chuyển hóa chủ yếu tại gan thành dạng có hoạt tính aflatoxin exo-
8,9-epoxide hoặc hydroxyl hóa thành AFM1 ít độc tính hơn bởi cytochrome
P450, một họ enzyme trong tế bào gan. Sự epoxide hóa AFB1 là một bước
nguy hiểm gây nguy cơ đột biến gen và ung thư. Aflatoxin exo-8,9-epoxide là
một chất rất ái điện tử, không bền vững, nó liên kết ái lực cao với guanine
base trong DNA tạo thành aflatoxin-N7-guanine. Aflatoxin-N7-guanine
methyl hóa biến G thành T, gây đột biến gen và có thể là nguyên nhân dẫn
đến ung thư [13,19].
Aflatoxin exo-8,9 -epoxide và sản phẩm hydrat hóa của nó là
dihydrodiol, gắn kết cộng hóa trị với DNA, RNA làm thay đổi cấu trúc và ảnh
hưởng chức năng của acid nucleic và protein. Aflatoxin exo-8,9-epoxide còn
ức chế enzyme RNA polymerase và ribosomal translocase, ảnh hưởng đến
quá trình phiên mã và dịch mã [12].
AFB1 ức chế enzyme glycogen synthetase và transglycosylase làm
giảm glycogen ở gan và tăng glucose trong máu. AFB1 ức chế
phosphoglucomutase – một enzyme xúc tác thuận nghịch phản ứng chuyển
G6P Glucose-6-phosphate thành Glucose-1-phosphate, dẫn đến tích lũy G6P
Glucose-6-phosphate và giảm tổng hợp glycogen [12].
8](https://image.slidesharecdn.com/khoalunxydngphngphpnhlngaflatoxintrongdcliubnglc-msms-230412091444-36aac180/75/Khoa-Lu-n-Xay-D-ng-Ph-ng-Phap-D-nh-L-ng-Aflatoxin-Trong-D-c-Li-u-B-ng-Lc-MsMs-18-2048.jpg)
![Aflatoxin còn ảnh hưởng đến DNA và cấu trúc ty thể. Aflatoxin-8,9-
epoxide ưu tiên gắn vào DNA của ty thể hơn là DNA nhân tế bào cản trở sản
xuất ATP làm mất chức năng tổng hợp năng lượng dưới dạng ATP của ty thể
và gây tăng chết tế bào theo chương trình (apoptosis) [12,13].
1.1.5. Độc tính của aflatoxin lên cơ thể người
Aflatoxicosis là tình trạng bệnh lý do nhiễm độc aflatoxin, ở người phơi
nhiễm với aflatoxin có thể xảy ra aflatoxicosis cấp hoặc mạn tính [9,13].
Độc tính cấp bao gồm: sốt cao, xuất huyết, tổn thương gan cấp với biểu
hiện nhiễm độc gan nặng (tỷ lệ tử vong 25%), phù, rối loạn tiêu hóa, rối loạn
hấp thu và/hoặc chuyển hóa chất dinh dưỡng, th ậm chí có thể gây tử vong.
Aflatoxicosis nguyên phát cấp tính xuất hiện khi phơi nhiễm với lượng trung
bình đến lượng lớn aflatoxin [12,14].
Độc tính mạn của aflatoxin B1 do tiêu thụ lượng thấp đến trung bình
aflatoxin, thường không có biểu hiện lâm sàng và khó nhận ra. Sau thời gian
phơi nhiễm kéo dài, AFB1 có thể gây quái thai và tật nguyền bẩm sinh; đột
biến gen làm thay đổi mã gen và DNA, phá vỡ nhiễm sắc thể, tái sắp xếp các
mảnh nhiễm sắc thể, tăng thêm hoặc mất hoàn toàn nhiễm sắc thể; gây ung
thư trong đó HCC (ung thư biểu mô tế bào gan) là loại ung thư thường gặp do
AFB1 [12,14].
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng những thức ăn nhiễm độc AFB1 là
yeus tố nguy cơ chính dẫn đến ung thư gan. IARC phân loại AFB1 là tác nhân
gây HCC nhóm I [23]. Cơ chế HCC do AFB1 được chứng minh là do đột biến
gen p53 – gen ức chế khối u. Một số nghiên cứu tại Trung Quốc và Nam Phi
cho thấy có đột biến ở codon 249 (guanine (G) thành thymine (T), kết quả là
argenine (R) chuyển thành serine (S)), exon 7 trên gen p53 ở những bệnh
nhân HCC [14]. Nguy cơ mắc HCC tăng lên khi đồng phơi nhiễm với AFB1
và virus HBV hoặc HCV [27]. Ở những cá thể có HbsAg dương tính,
aflatoxin có tiềm năng gây độc gấp 30 lần ở những người không nhiễm virus.
9](https://image.slidesharecdn.com/khoalunxydngphngphpnhlngaflatoxintrongdcliubnglc-msms-230412091444-36aac180/75/Khoa-Lu-n-Xay-D-ng-Ph-ng-Phap-D-nh-L-ng-Aflatoxin-Trong-D-c-Li-u-B-ng-Lc-MsMs-19-2048.jpg)
![Nhiễm HBV tăng nguy cơ ung thư gan lên 5 lần trong khi đồng phơi nhiễ m
virus HBV và aflatoxin tăng nguy cơ ung thư gan lên 60 lần [17]. Ngoài ra
ung thư phổi do AFB1 cũng được báo cáo ở những người phơi nhiễm kéo dài
với sản phẩm đã nhiễm độc aflatoxin qua đường hô hấp [19].
AFB1 còn được báo cáo có liên quan đến hội chứng giống như hội
chứng Reye ở trẻ em với những triệu chứng như ho, sốt, thay đổi trương lực
cơ, nôn. Giải phẫu cho thấy hình ảnh gan to nhiễm mỡ, phù não, thoái hóa mỡ
nội tạng, thoái hóa thần kinh. Khi gan bị tổn thương do AFB1 dẫn đến
amoniac – sản phẩm chuyển hóa protein và acid amin – không được giải độc
khỏi cơ thể, đạt nồng độ cao trong cơ thể, đi qua hàng rào máu não và gây hội
chứng não gan [12].
Do có độc tính cao, nhiều quốc gia đã đưa ra các quy định để kiểm soát
hàm lượng aflatoxin trong thực phẩm và các sản phẩm nông nghiệp có nguy
cơ lây nhiễm cao. Trong Dược điển Trung Quốc 2015 và Dược điển Hồng
Kông, quy định giới hạn tổng hàm lượng aflatoxin (AFG1, AFG2, AFB1,
AFB2) trong dược liệu không được quá 10 µg/kg và hàm lượng AFB1 không
được quá 5 µg/kg. Liên minh châu Âu (EU) quy định tổng hàm lượng
aflatoxin không được quá 4 µg/kg và hàm lượng AFB1 không quá 2 µg/kg
[18].
Thep FDA, nhiễm độc aflatoxin trong sản phẩm nông nghiệp và dược
liệu là khó tránh khỏi, hàng năm có rất nhiều người có nguy cơ phơi nhiễm
với aflatoxin. Tuy nhiên, nguy cơ nhiễm độc và độc tính aflatoxin có thể được
giảm tớ i mức tối thiểu nhờ các phương pháp kiểm soát và phát hiện aflatoxin
trong sản phẩm và dược liệu.
1.1.6. Những nghiên cứu về phương pháp định lượng aflatoxin trong
dược liệu
10](https://image.slidesharecdn.com/khoalunxydngphngphpnhlngaflatoxintrongdcliubnglc-msms-230412091444-36aac180/75/Khoa-Lu-n-Xay-D-ng-Ph-ng-Phap-D-nh-L-ng-Aflatoxin-Trong-D-c-Li-u-B-ng-Lc-MsMs-20-2048.jpg)
![Bảng 1. 2. Một số nghiên cứu định lượng aflatoxin trong và ngoài nước
TT
Phương pháp Phương
Dung môi chiết Điều kiện sắc ký
Hoạt chất định
TLTK
phân tích pháp chiết lượng
I Các nghiên cứu trên Thế giớ i
Phương + Pha tĩnh: LiChrocart C18 short column
pháp chiết (30mm × 4 mm, 3ϻ m)
aflatoxin B1, B2,
lạnh + methanol : nước + Pha động: methanol – nước
1 LC-MS/MS G1, G2 trên nến mẫu [26]
chiết pha (80:20, v/v) (30:70)
Rhammus purshiana
rắn để làm + Tốc độ dòng: 1mL/phút
giàu + Detector phát hiện: ESI (+) - SIM
methanol : + Pha tĩnh: Scharlau Chemie C18 aflatoxin B1, B2,
Phương
nước (70:30,
column (250 × 4.6 mm i.d.) G1, G2 trên các nền
pháp chiết
v/v), methanol:
+ Pha động: methanol:nước (52:48, v/v) mẫu như Valeriana
lạ nh + với 119 mg/L Kali bromide và 100µL/L officinalis,
2 LC-FLD nước (80:20, [16]
chiết pha acid nitric 65%. Hypericum
v/v) và
rắn để làm + Tốc độ dòng: 1,2 mL/phút perforatum, Cassia
methanol :
giàu + Detector phát hiện: máy dò huỳnh angustifolia, Mentha
nitric acid1% quang FP-1520, bước sóng kích thích và pulegium và
11](https://image.slidesharecdn.com/khoalunxydngphngphpnhlngaflatoxintrongdcliubnglc-msms-230412091444-36aac180/75/Khoa-Lu-n-Xay-D-ng-Ph-ng-Phap-D-nh-L-ng-Aflatoxin-Trong-D-c-Li-u-B-ng-Lc-MsMs-21-2048.jpg)
![(70:30, v/v) phát xạ tương ứng là 365 và 435nm. Chrysanthemum
parthenium
+ Pha tĩnh: Shim-Pack CLC – ODS
Column (5µm, 4.6 x 250 mm)
Phương
+ Pha động: dung dịch khử ion hon hợp
nước-acetonitrile-methanol (60:20:20,
pháp chiết
methanol : v/v/v) bổ sung 350 µL HNO3 4M and AFB1 trong thuốc
lạnh +
3 LC-FLD nước (85:15, 120 mg KBr. từ thảo dược và [24]
chiết pha
v/v) + Tốc độ dòng: 1 mL/phút dược liệu
rắn để làm
+ Detector phát hiện: máy dò huỳnh
giàu
quang Shimadzu LC-10 AD Model,
bước sóng kích thích và phát xạ tương
ứng là 360 và 435nm.
II Các nghiên cứu trong nước
Phương + Pha tĩnh: Betabasic 18 (2,0mm x
pháp chiết methanol : 50mm, 5ϻm)
Các loại aflatoxin
4 LC-MS lạnh + nước (85:15, + Pha động: kênh A: nước; kênh B: [2]
trong dược liệu
chiết pha v/v) methanol; chạy chế độ Gradient.
rắn để làm + Tốc độ dòng: 0,2ml/phút.
12](https://image.slidesharecdn.com/khoalunxydngphngphpnhlngaflatoxintrongdcliubnglc-msms-230412091444-36aac180/75/Khoa-Lu-n-Xay-D-ng-Ph-ng-Phap-D-nh-L-ng-Aflatoxin-Trong-D-c-Li-u-B-ng-Lc-MsMs-22-2048.jpg)
![giàu + Detector phát hiện: ESI (+) - SIM
Phương
+ Pha tĩnh: cột C18 Acquity UPLC BEH
(2,1x100 mm, 1,7ϻm)
pháp chiết
+ Pha động: kênh A: amoni acetat
lạnh + methanol : aflatoxin B1 trong
5 LC-MS 10mM; kênh B: methanol; chạ y chế độ [7]
chiết pha nước (6:4, v/v) dược liệu
Gradient.
rắn để làm
+ Tốc độ dòng: 0,4 mL/phút
giàu
+ Detector phát hiện: ESI (+) - SIM
13](https://image.slidesharecdn.com/khoalunxydngphngphpnhlngaflatoxintrongdcliubnglc-msms-230412091444-36aac180/75/Khoa-Lu-n-Xay-D-ng-Ph-ng-Phap-D-nh-L-ng-Aflatoxin-Trong-D-c-Li-u-B-ng-Lc-MsMs-23-2048.jpg)
![1.2. Tổng quan về sắc ký ái lực miễn dịch và sắc ký lỏng – khối phổ
(LC-MS/MS)
1.2.1. Sắc ký ái lực miễn dịch
a) Sắc ký ái lực
Sắc ký ái lực là một kỹ thuật sắc ký lỏng sử dụng một thuố c thử liên kết
đặc biệt để làm sạch hoặc phân tích các thành phần trong hỗn hợp. Lưu giữ
chất phân tích là do tương tác thuận nghịch và chọn lọc của các cặp có trong
cơ thể sống như: kháng nguyên – kháng thể, enzyme – cơ chất, hormone –
receptor...[1].
Để thực hiện sắc ký ái lực người ta cố đị nh một thành phần của cặp
(phối tử - ái lực) trên một chất mang rắn làm pha tĩnh đưa vào cột. Mẫu phân
tích có thành phần thứ hai được đưa vào cột nhờ một pha động có pH xác
định, lực ion và thành phần dung môi phù hợp gọi là dung dịch đệm rửa giải.
Khi mẫu phân tích qua cột, các thành phần khác khuếch tán dễ dàng, chỉ có
hai thành phần của cặp tương tác đặc hiệu và liên kết với nhau. Nhờ một dung
dịch đệm rửa giải, liên kết trên bị phá vỡ và thành phần chọn lọc với phối tử
ái lực đi ra khỏi cột. Phát hiện và định lượng bằng một detector thích hợp [1].
- Phối tử ái lực: là những chất có tính đặc hiệu cao với chất phân tích,
quyết định thành công của kỹ thuật tách ái lực. Phối tử ái lực có thể có nguồn
gốc sinh học (kháng thể, protein...) hoặc nguồn gốc hóa học (boronat, phức
càng cua kim loại...).
- Chấ t mang: là những chất rắn được dùng để cố định phối lực ái tử
trong cộ t sắc ký. Một số chất mang thường dùng trong sắc ký ái lực là
agarose và agarose liên kết, cellulose, silica...
b) Sắc ký ái lực miễn dịch
Sắc ký ái lực miễn dịch là một loại hình sắc ký ái lực sử dụng phối tử ái
lực là kháng thể hoặc kháng nguyên. Do tính đặc hiệu cao của tương tác
kháng thể - kháng nguyên và khả năng tạo kháng thể của nhiều loại chất, kỹ
15](https://image.slidesharecdn.com/khoalunxydngphngphpnhlngaflatoxintrongdcliubnglc-msms-230412091444-36aac180/75/Khoa-Lu-n-Xay-D-ng-Ph-ng-Phap-D-nh-L-ng-Aflatoxin-Trong-D-c-Li-u-B-ng-Lc-MsMs-25-2048.jpg)
![thuật sắc ký ái lực miễn dịch trở thành một công cụ phổ biến và quan trọng
trong phân tích các chất có nguồn gốc sinh học [1].
Kỹ thuật sắc ký ái lực miễn dịch còn được ứng dụng để tinh chế và làm
giàu chất phân tích trong cột chiết pha rắn (SPE) với nhiều ưu điể m [25]:
- Sử dụng ít dung môi.
- Có tính đặc hiệu cao với chất phân tích.
- Làm giàu mẫu cho kết quả phân tích tốt hơn.
Nhược điểm của kỹ thuật này là chi phí cao do cột chỉ dùng được một
lần (kháng thể bị biến tính) [25].
1.2.2. Sắc ký lỏng khối phổ
a) Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
HPLC là một kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua
cột chứa các hạt pha tĩnh. Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số
phân bố của chúng giữa hai pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của các
chất này với pha tĩnh và pha động. Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy
phụ thuộc vào các yếu tố đó. Thời gian chất phân tích được rửa giải được ghi
lại nhờ detector gọi là thời gian lưu. Thời gian lưu phụ thuộc vào bản chất của
chất phân tích và thành phần của pha động và pha tĩnh [1].
Pha tĩnh
Trong HPLC, pha tĩnh là các hợp chất được gắn lên chất mang thường
là các hạt hình cầu có đường kính 1,5–10 ϻm, có nhiệm vụ tách hỗn hợp chất
phân tích. Pha tĩnh có độ phân cực khác nhau, dựa vào độ phân cực của pha
tĩnh mà người ta phân ra hai loại: sắc ký pha thuận và sắc ký pha đảo.
- Sắc ký pha thuận: pha tĩnh phân cực (các silica có chứa nhóm alkyl
ít cacbon mang nhóm chức phân cực –CN, -NH2 ...).
- Sắc ký pha đảo: pha tĩnh không phân cực (các silica gắn mạch
cacbon dài C18, C8...).
Pha động
16](https://image.slidesharecdn.com/khoalunxydngphngphpnhlngaflatoxintrongdcliubnglc-msms-230412091444-36aac180/75/Khoa-Lu-n-Xay-D-ng-Ph-ng-Phap-D-nh-L-ng-Aflatoxin-Trong-D-c-Li-u-B-ng-Lc-MsMs-26-2048.jpg)
![Pha động trong HPLC là dung môi hoặc hỗn hợp dung môi rửa giải các
chất phân tích ra khỏi cột sắc ký. Trong sắc ký pha thuận, pha động là các
dung môi ít phân cực như hexan, iso propyl ether..., ngược lại trong sắc ký
pha đảo, pha động là các dung môi phân cực như nước, methanol, acetonitril...
Có hai cách dùng pha động để rửa giải [1]:
- Đẳng dòng: các thành phần pha động không thay đổi trong suốt quá
trình chạy sắc ký.
- Gradient: tỷ lệ các thành phần dung môi pha động thay đổi trong quá
trình chạy sắc ký. Chế độ này phù hợp với mẫu phân tích nhiều thành phần
với khả năng phân cực khác nhau, tăng khả năng rửa giải, rút ngắn thời gian
phân tích.
b) Khối phổ (MS)
Nguyên tắc:
Khối phổ là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion
(m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu. Các
ion được tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ
phận phân tích khối trước khi đến detector. Tất cả các quá trình này diễn ra
trong hệ thiết bị chân không: áp suất trong hệ dao động từ 10-3 Pa đến 10-6
Pa.
Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng một số vạch (pic)
có cường độ khác nhau tập hợp lại thành phổ khối. Nó cung cấp thông tin
định tính xác định cấu trúc và định lượng các chất [1].
Máy khối phổ gồm có 5 bộ phận: bộ nạp mẫu, bộ nguồn ion, bộ phân
tích khối, detector, bộ xử lý dữ liệu:
17](https://image.slidesharecdn.com/khoalunxydngphngphpnhlngaflatoxintrongdcliubnglc-msms-230412091444-36aac180/75/Khoa-Lu-n-Xay-D-ng-Ph-ng-Phap-D-nh-L-ng-Aflatoxin-Trong-D-c-Li-u-B-ng-Lc-MsMs-27-2048.jpg)
![Sắc ký lỏng – khối phổ là kỹ thuật sắc ký lỏng có đầu ra kết nối v ới
khối phổ. Bộ nguồn ion hóa bằng phun sương khử solvat cho phép chuyền
chất phân tích từ pha lỏng sang pha hơi để ion hóa. Phương pháp sắc ký lỏng
– khối phổ được ứng dụng nhiều trong phân tích các chất độc và xác định
nồng độ thuốc trong cơ thể do có nhiều ưu điểm như [1]:
- Cho thông tin về cấu trúc chất phân tích.
- Tính chọn lọc cao.
- Độ nhạy cao, giới hạn phát hiện có thể đến 10-14 gam nên kỹ thuật này
thường được dùng để phân tích hàm lượng siêu vế t.
- Có thể phân tích các chất dựa vào tỷ lệ m/z của ion phân tử và ion sản phẩm
mà không cần tách hoàn toàn các thành phần trong mẫu có nhiều thành phần.
20](https://image.slidesharecdn.com/khoalunxydngphngphpnhlngaflatoxintrongdcliubnglc-msms-230412091444-36aac180/75/Khoa-Lu-n-Xay-D-ng-Ph-ng-Phap-D-nh-L-ng-Aflatoxin-Trong-D-c-Li-u-B-ng-Lc-MsMs-30-2048.jpg)
![CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Khảo sát điều kiện khối phổ
Kỹ thuật FIA (Flow injection analysis) là một kỹ thuật phân tích sử
dụng trong HPLC mà không sử dụng cột sắc ký. Ứng dụng trong khảo sát phổ
khối, dung dịch chuẩn hỗn hợp chứa AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 có nồng
độ mỗi chất 100 ppb được tiến hành tiêm vào hệ thống khối phổ với các điều
kiện như sau:
- Điều kiện sắc ký:
+ Pha tĩnh: không lắp cột.
+ Pha động: ACN: amoni acetat 10 mM (50:50, v/v)
+ Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút
+ Thể tích tiêm: 1 uL.
- Điều kiện khối phổ:
+ Nebulizing Gas Flow: 3 L/ phút.
+ Heating Gas Flow: 10 L/ phút.
+ Interface Temperature: 300 o
C.
+ DL Temperature: 250o
C.
+ Heat block Temperature: 400o
C.
+ Drying Gas Flow: 10 L/ phút.
+ Interface Voltage: -5kV đối với ESI-positive
Kết qu ả thu được khi quan sát ở chế độ ESI-positive, thấy có mảnh ion
mẹ [M+H]+
c ủa AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 có giá trị m/z tương ứng là
313,20; 315,20; 329,15 và 331,15. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu đã
được công bố trước đây.
27](https://image.slidesharecdn.com/khoalunxydngphngphpnhlngaflatoxintrongdcliubnglc-msms-230412091444-36aac180/75/Khoa-Lu-n-Xay-D-ng-Ph-ng-Phap-D-nh-L-ng-Aflatoxin-Trong-D-c-Li-u-B-ng-Lc-MsMs-38-2048.jpg)
![Inten.(x10,000,000)
1.00
313. 20
0.75
329.15
0.50
315.20
0.25
331.15
0.00
307.5 310.0 312.5 315.0 317.5 320.0 322.5 325.0 327.5 330.0 332.5 335.0 m/z
Hình 3.1. Phổ khối của AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 quan sát dưới chế độ
ESI-positive
Sau đó tiếp tục áp dụng kỹ thuật FIA để tiến hành tối ưu hóa điều kiện
MS/MS tự động. Tiến hành tiêm trực tiế p dung dịch chuẩn hỗn hợp chứa
AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 có nồng độ mỗi chất 100 ppb, cài đặt thông số
máy để tiến hành tối ưu hóa điều kiện phân mảnh 2 ion con đối với mỗi chất.
Kết quả thu được được trình bày trong Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Thông số MS tối ưu
TT Độc tố
Ion mẹ Mảnh Dwell Time
Q1 (V)
CE Q3
[M+H]+
con (msec) (eV) (V)
1 AFB1 313,20
241,05 25 -11,0 -39,0 -23,0
284,95 25 -20,0 -25,0 -25,0
2 AFB2 315,20
286,95 25 -12,0 -25,0 -27,0
259,20 25 -12,0 -33,0 -27,0
3 AFG1 329,15
243,10 25 -24,0 -23,0 -30,0
311,05 25 -23,0 -27,0 -22,0
4 AFG2 331,15
313,00 25 -25,0 -25,0 -29,0
245,00 25 -22,0 -29,0 -23,0
28](https://image.slidesharecdn.com/khoalunxydngphngphpnhlngaflatoxintrongdcliubnglc-msms-230412091444-36aac180/75/Khoa-Lu-n-Xay-D-ng-Ph-ng-Phap-D-nh-L-ng-Aflatoxin-Trong-D-c-Li-u-B-ng-Lc-MsMs-39-2048.jpg)
![gọn, cân xứng và giảm hiện tượng chẻ píc. Vì vậy chúng tôi lựa chọn chương
trình gradient 2 để tiến hành các khảo sát tiếp theo.
Bảng 3. 3. Các thông số sắc ký ứng với chương trình gradient 2
Thông số AFB1 AFB2 AFG1 AFG2
Hệ số đối xứng (As) 1,077 1,121 1,082 1,203
tR (phút) 3,130 3,038 3,040 2,940
Như vậy, chúng tôi đã khảo sát được điều kiện sắc ký và điều kiện khối phổ
như sau:
Điều kiện khối phổ:
+ Nebulizing Gas Flow: 3 L/
phút.
+ Heating Gas Flow: 10 L/ phút.
+ Interface Temperature: 300 o
C.
+ DL Temperature: 250o
C.
+ Heat block Temperature: 400o
C.
+ Drying Gas Flow: 10 L/ phút.
+ Interface Voltage: -5kV.
+ Chế độ: ESI
TT Độc tố
Ion mẹ Mảnh Dwell Time
Q1 (V)
CE Q3
[M+H]+
con (msec) (eV) (V)
1 AFB1 313,20
241,05 25 -11,0 -39,0 -23,0
284,95 25 -20,0 -25,0 -25,0
2 AFB2 315,20
286,95 25 -12,0 -25,0 -27,0
259,20 25 -12,0 -33,0 -27,0
3 AFG1 329,15
311,05 25 -23,0 -27,0 -22,0
243,10 25 -24,0 -23,0 -30,0
4 AFG2 331,15
313,00 25 -25,0 -25,0 -29,0
245,00 25 -22,0 -29,0 -23,0
32](https://image.slidesharecdn.com/khoalunxydngphngphpnhlngaflatoxintrongdcliubnglc-msms-230412091444-36aac180/75/Khoa-Lu-n-Xay-D-ng-Ph-ng-Phap-D-nh-L-ng-Aflatoxin-Trong-D-c-Li-u-B-ng-Lc-MsMs-43-2048.jpg)
![Bảng 3.5. Hiệu suất thu hồi của các aflatoxin với các dung môi làm sạch
TT Độc tố
Dung môi làm sạch
PBS MeOH : H2O (5 : 95) MeOH : H2O (25 : 75)
1 AFB1 88,5% 83,5% 80,1%
2 AFB2 89,1% 84,4% 81,2%
3 AFG1 86,2% 80,1% 78,4%
4 AFG2 86,3% 81,2% 75,3%
Nhận xét: Kết quả thu được cho thấy, khi sử dụng dung môi làm sạch
là MeOH : H2O với tỷ lệ MeOH tăng dần thì hiệu suất thu hồi giảm đi. Vì vậy
chúng tôi lựa chọn dung dịch PBS làm dung môi làm sạch.
3.4. Thẩm định phương pháp
3.4.1. Độ chọn lọc của phương pháp
Để xác định tính chọn lọc đối với sắc kí khối phổ, chúng tôi sử dụng
phương pháp xác nhận. Hội đồng châu Âu quy định cách tính điểm IP (điểm
nhận dạng – indenfication point) đối với sắc ký lỏng khối phổ 2 lần (LC-
MS/MS) là 4. Tức là cần có 1 ion mẹ bắn phá ra 2 ion con.
Bảng 3.6. Ion mẹ và ion con của aflatoxin
TT Độc tố
Ion mẹ
Ion con Vai trò Số điểm IP
[M+H]+
1 AFB1 313,20
241,05 Định lượng
4
284,95 Định tính
2 AFB2 315,20
286,95 Định lượng
4
259,20 Định tính
3 AFG1 329,15
243,10 Định lượng
4
311,05 Định tính
4 AFG2 331,15
313,00 Định lượng
4
245,00 Định tính
35](https://image.slidesharecdn.com/khoalunxydngphngphpnhlngaflatoxintrongdcliubnglc-msms-230412091444-36aac180/75/Khoa-Lu-n-Xay-D-ng-Ph-ng-Phap-D-nh-L-ng-Aflatoxin-Trong-D-c-Li-u-B-ng-Lc-MsMs-46-2048.jpg)
![Bảng 3.10. Độ lặp lại và độ thu hồi của aflatoxin trên nền mẫu dược liệu
Mức Nồng độ (ppb) Độ thu hồi (%)
thêm Mẫu
AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 AFB1 AFB2 AFG1 AFG2
chuẩn
TT-1 1,21 1,12 1,33 1,26 96,8 89,6 106,4 100,8
2,5
TT-2 1,20 1,41 1,35 1,35 96,0 112,8 108,0 108,0
TT-3 1,19 1,02 1,05 1,37 95,2 81,6 84,0 109,6
µg/kg
TT-4 1,35 1,11 1,43 1,09 108,0 88,8 114,4 87,2
tương
ứng TT-5 1,09 1,09 1,11 1,13 87,2 87,2 88,8 90,4
1,25
TT-6 1,42 1,31 1,34 1,39 113,6 104,8 107,2 111,2
ppb
TB 1,24 1,18 1,27 1,27
SD 0,11 0,14 0,14 0,12
RSD(%) 8,81 11,61 10,89 9,28
TT-1 2,32 2,43 2,47 2,33 92,8 97,2 98,8 93,2
TT-2 2,46 2,16 2,59 2,34 98,4 86,4 103,6 93,6
5 TT-3 2,39 2,33 2,23 2,17 95,6 93,2 89,2 86,8
µg/kg TT-4 2,22 2,37 2,34 2,29 88,8 94,8 93,6 91,6
tương
TT-5 2,09 2,19 2,21 2,47 83,6 87,6 88,4 98,8
ứng
TT-6 2,04 2,12 2,25 2,52 81,6 84,8 90,0 100,8
2,5
ppb TB 2,25 2,27 2,35 2,35
SD 0,17 0,13 0,15 0,13
RSD(%) 7,40 5,59 6,49 5,37
TT-1 3,71 3,65 3,47 3,44 98,9 97,3 92,5 91,7
TT-2 3,55 3,45 3,79 3,67 94,7 92,0 101,1 97,9
7,5 TT-3 3,35 3,49 3,55 3,73 89,3 93,1 94,7 99,5
µg/kg TT-4 3,79 3,67 3,89 3,53 101,1 97,9 103,7 94,1
tương
TT-5 3,42 3,51 3,65 3,69 91,2 93,6 97,3 98,4
ứng
TT-6 3,84 3,93 3,74 3,45 102,4 104,8 99,7 92,0
3,75
ppb TB 3,61 3,62 3,68 3,59
SD 0,20 0,18 0,16 0,13
RSD(%) 5,58 4,90 4,24 3,56
Nhận xét: Theo quy định của AOAC, phần trăm tìm lại tại khoảng
nồng độ 1 – 5 µg/Kg đạt trong khoảng 40 – 120% và RSD(%) ≤ 30 [3]. Kết
quả thu được có độ đúng từ 81,6 - 113,6% và RSD(%) từ 3,56 - 11,61%](https://image.slidesharecdn.com/khoalunxydngphngphpnhlngaflatoxintrongdcliubnglc-msms-230412091444-36aac180/75/Khoa-Lu-n-Xay-D-ng-Ph-ng-Phap-D-nh-L-ng-Aflatoxin-Trong-D-c-Li-u-B-ng-Lc-MsMs-52-2048.jpg)
![CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN
Như vậy, nhóm nghiên cứu đã tiến hành xây dựng và thẩm đị nh
phương pháp định lượng các aflatoxin (AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2) trong
dược liệu với quy trình phân tích như sau:
Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 25 g dược liệu vào bình nón
dung tích 250 ml. Thêm khoảng 5 g NaCl. Thêm chính xác 100 ml dung môi
chiết methanol : nước tỷ lệ 80 : 20. Lắc ngang trên máy lắc ngang 30 phút.
Lọc lấy dịch lọc. Lấy chính xác 10 ml dịch lọc, pha loãng với 40 ml nước. Ly
tâm, lấy dịch lọc. Lấy chính xác 10 ml dịch lọ c mẫu bên trên. Cho qua cột
SPE-IM với tốc độ 1 ml/phút. Rửa tạp bằng 20 ml dung dịch đệm PBS. Rửa
giải bằng 1 ml methanol. Lọc qua màng lọc 0,22 µm thu được dung dịch sắc
ký.
+ Nebulizing Gas Flow: 3 L/
phút.
+ Heating Gas Flow: 10 L/ phút.
+ Interface Temperature: 300 o
C.
+ DL Temperature: 250o
C.
+ Heat block Temperature: 400o
C.
+ Drying Gas Flow: 10 L/ phút.
+ Interface Voltage: -5kV.
+ Chế độ: ESI
TT Độc tố
Ion mẹ Mảnh Dwell Time
Q1 (V)
CE Q3
[M+H]+
con (msec) (eV) (V)
1 AFB1 313,20
241,05 25 -11,0 -39,0 -23,0
284,95 25 -20,0 -25,0 -25,0
2 AFB2 315,20
286,95 25 -12,0 -25,0 -27,0
259,20 25 -12,0 -33,0 -27,0
3 AFG1 329,15
311,05 25 -23,0 -27,0 -22,0
243,10 25 -24,0 -23,0 -30,0
4 AFG2 331,15
313,00 25 -25,0 -25,0 -29,0
245,00 25 -22,0 -29,0 -23,0
44](https://image.slidesharecdn.com/khoalunxydngphngphpnhlngaflatoxintrongdcliubnglc-msms-230412091444-36aac180/75/Khoa-Lu-n-Xay-D-ng-Ph-ng-Phap-D-nh-L-ng-Aflatoxin-Trong-D-c-Li-u-B-ng-Lc-MsMs-57-2048.jpg)
More Related Content
Similar to Khoá Luận Xây Dựng Phương Pháp Định Lượng Aflatoxin Trong Dược Liệu Bằng Lc-MsMs.
More from Nhận Viết Thuê Đề Tài Vietkhoaluan.com / Zalo : 0917.193.864
Khoá Luận Xây Dựng Phương Pháp Định Lượng Aflatoxin Trong Dược Liệu Bằng Lc-MsMs.
- 1. ĐẠI HỌC QUỐCGIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC -------- -------- XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG AFLATOXIN TRONG DƯỢC LIỆU BẰNG LC-MS/MS DỊCH VỤ VIẾT THUÊ ĐỀ TÀI TRỌN GÓI ZALO TELEGRAM : 0917.193.864 TẢI FLIE TÀI LIỆU – VIETKHOALUAN.COM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội – 2023
- 2. ĐẠI HỌC QUỐCGIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC -------- -------- HÀ ANH TUẤN XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG AFLATOXIN TRONG DƯỢC LIỆU BẰNG LC-MS/MS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC KHÓA: QH.2014.Y Người hướng dẫn 1: TS. Nguyễn Thị Phương Người hướng dẫn 2: TS. Nguyễn Hữu Tùng Hà Nội – 2023
- 3. LỜI CẢM ƠN Bảnluận văn này được hoàn thành tại Khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Thị Phương và TS. Nguyễn Hữu Tùng. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Thị Phương (Khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu) và TS. Nguyễn Hữu Tùng (Bộ môn Hóa dược và kiểm nghiệm, Khoa Y Dược - ĐHQGHN) là những người thầy đã hướng dẫn, chỉ bảo, góp ý và đưa ra những ý kiến quý báu để em hoàn thiện khóa luận. Em xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Phương Thiện Thương (Trưởng khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu) cùng với các anh chị,bạn bè, cán bộ, nhân viên khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu đã giúp đỡ em, đặc biệt là anh Nguyễn Đình Quân - người đã luôn theo sát, hướng dẫn cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô trong Khoa Y – Dược đã dạy dỗ, trang bị kiến thức cho em trong suốt 5 năm theo học tại trường. Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã luôn ở bên cạnh, ủng hộ, động viên em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận. Cuối cùng, em xin chúc các thầy cô mạnh khỏe, hạnh phúc và thành công trong công việc cũng như trong cuộc sống. Hà Nội, ngày 16 tháng 04 năm 2023 Sinh viên Hà Anh Tuấn
- 4. MỤC LỤC DANH MỤCCÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ...................................................................................................1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN.............................................................................2 1.1. Tổng quan về aflatoxin .........................................................................2 1.1.1. Giới thiệu về aflatoxin....................................................................2 1.1.2. Tính chất hóa lý ..............................................................................2 1.1.3. Điều kiện sinh aflatoxin..................................................................7 1.1.4. Cơ chế gây bệnh của aflatoxin .......................................................8 1.1.5. Độc tính của aflatoxin lên cơ thể người .........................................9 1.1.6. Những nghiên cứu về phương pháp định lượng aflatoxin trong dược liệu....................................................................................................10 1.2. Tổng quan về s ắc ký ái lực miễn dịch và sắc ký lỏng – khối phổ (LC- MS/MS)........................................................................................................15 1.2.1. Sắc ký ái lực miễn dịch.................................................................15 1.2.2. Sắc ký lỏng khối phổ ....................................................................16 CHƯƠNG2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...............21 2.1. Đối tượng nghiên cứu .........................................................................21 2.2. Chất chuẩn, hóa chất và thiết bị............................................................21 2.2.1. Chất chuẩn ......................................................................................21 2.2.2. Hóa chất ..........................................................................................21 1
- 5. 2.2.3. Thiết bị,dụng cụ ............................................................................. 22 2.3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................. 22 2.3.1. Thu thập mẫu nghiên cứu ............................................................... 22 2.3.2. Xây dựng phương pháp định lượng aflatoxin trong dược liệu .......22 2.3.3. Áp dụng phương pháp đánh giá hàm lượng aflatoxin trong các mẫu dược liệu giàu tinh bột trên thị trường Hà Nội ......................................... 23 2.4. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 23 2.4.1. Phương pháp thu thập và xử lý sơ bộ mẫ u thử ............................... 23 2.4.2. Khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc kí ................................................ 23 2.4.3. Quy trình thẩm định phương pháp .................................................. 23 2.4.3.1. Tính đặc hiệu/ chọn lọc ................................................................ 23 2.4.3.2. Giới hạn phát hiện (LOD), Giới hạn định lượng (LOQ) ............. 24 2.4.3.3. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn ............................................. 24 2.4.3.4. Độ lặp lại và độ thu hồi ................................................................ 25 2.4.4. Phương pháp xử lý số liệu .............................................................. 26 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN..................................................... 27 3.1. Khảo sát điều kiện khối phổ .................................................................. 27 3.2. Khảo sát điều kiện sắc ký ...................................................................... 29 3.2.1. Lựa chọn pha tĩnh ........................................................................... 29 3.2.2. Khảo sát pha động ........................................................................... 30 3.3. Khảo sát quy trình xử lý mẫu ................................................................ 33 3.3.1. Khảo sát dung môi chiết mẫu ......................................................... 33 3.3.2. Khảo sát dung môi làm sạch ........................................................... 34 3.4. Thẩm định phương pháp ....................................................................... 35 2
- 6. 3.4.1. Độ chọnlọc của phương pháp ........................................................35 3.4.2. Tính phù hợp hệ thống....................................................................36 3.4.3. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính................................................37 3.4.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) .............39 3.4.5. Độ lặp lại và độ thu hôi...................................................................40 3.5. Áp dụng phương pháp đánh giá hàm lượng aflatoxin trong dược liệu . 42 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO 3
- 7. DANH MỤC CÁCCHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tên tiếng Anh hoặc tên khoa học Tiếng Việt AF Aflatoxin AFB1 Aflatoxin B1 AFB2 Aflatoxin B2 AFG1 Aflatoxin G1 AFG2 Aflatoxin G2 AFM1 Aflatoxin M1 AFM2 Aflatoxin M2 AOAC Association of Official Analytical Hiệp hội các nhà phân Chemists tích hóa học CE/MS Capillary Electrophoresis – Mass Điện di mao quản – Spectrometry khối phổ CTCT Công thức cấu tạo CTPT Công thức phân tử CV% Coefficient of Variation Hệ số biến thiên ELISA Enzyme – Linked Immuno Sorbent Kỹ thuật miễn dịch liên Assay kết với enzyme ESI Electrospray Ionization Ion hóa bằng tia điện tử HCC Hepatocellular carcinoma Ung thư biểu mô tế bào gan HPLC High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu năng Chromatography cao High performance liquid Sắc ký lỏng hiệu năng HPLC-FLD chromatography- Fluorescence cao đầu dò huỳnh quang Detection IARC International Agency for Research Cơ quan nghiên cứ ung 1
- 8. on Cancer thưquốc tế LC-MS Liquid Chromatography Mass Sắc ký lỏng khối ph ổ Spectrometry LC-MS/MS Liquid Chromatography tandem Sắc ký lỏng khối phổ Mass Spectrometry hai l ần LOD Limit of detetion Giới hạn phát hiện LOQ Limit of quantitation Giới hạn định lượng MeOH Methanol PBS Phosphate-Buffered Saline Dung dịch đệm phosphat R% Recovery Độ thu hồi RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn SPE Solid phase extract Chiết pha rắn SPE-IM Solid phase extract-Immuno Chiết pha rắn với cột ái lực miễn dịch TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng TLPT Trọng lượng phân tử TLTK Tài liệu tham khảo 2
- 9. DANH MỤC CÁCBẢNG Bảng 1. 1.Tính chất của một vài aflatoxin ....................................................... 4 Bảng 1. 2.Một số nghiên cứu định lượng aflatoxin trong và ngoài nước ...... 11 Bảng 2.1. Danh sách các mẫu thu mua........................................................ 21 Bảng 3.1. Thông số MS tối ưu...................................................................... 28 Bảng 3. 2.Một số chương trình gradient khảo sát ......................................... 30 Bảng 3. 3.Các thông số sắc ký ứng với chương trình gradient 2 .................. 32 Bảng 3. 4. Hiệu suất thu hồi của các aflatoxin với các dung môi khác nhau. 34 Bảng 3. 5. Hiệu suất thu hồi của các aflatoxin với các dung môi làm sạch ... 35 Bảng 3. 6. Ion mẹ và ion con của các aflatoxin .............................................. 35 Bảng 3. 7. Kết quả đánh giá độ thích hợp hệ thống của phương pháp .......... 37 Bảng 3. 8. Quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích píc của các chất ... 38 Bảng 3. 9. Kết quả xác định LOD và LOQ của phương pháp ........................ 40 Bảng 3. 10. Độ lặp lại và độ thu hồi của aflatoxin trên nền mẫu dược liệu .. 41 3
- 10. DANH MỤC CÁCBẢNG VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1. Sơ đồ khối của máy khối phổ.......................................................... 18 Hình 1.2. Bộ phân tích tử cực chập ba ........................................................... 19 Hình 3.1. Phổ khối của AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 quan sát dưới chế độ ESI-positive ................................................................................................... 28 Hình 3. 2. Phổ khối của ion con các aflatoxin............................................... 29 Hình 3. 3.Sắc ký đồ chương trình gradient 1 ................................................. 31 Hình 3. 4.Sắc ký đồ chương trình gradient 2 ................................................. 31 Hình 3. 5.Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp ........................ 36 Hình 3. 6.Đường chuẩn của các độc tố aflatoxin .......................................... 39 4
- 11. ĐẶT VẤN ĐỀ Trongnhững năm gần đây, dược liệu cũng như các sản phẩm từ dược liệu được nhân dân sử dụng ngày càng nhiều. Để đảm bảo người dân được sử dụng những sản phẩm tốt nhất, cũng như an toàn cho sức khỏe, ngoài việc đảm bảo các tiêu chí trong Dược điển các sản phầm này cũng nên được kiểm tra đánh giá mức độ ô nhiễm các độc tố nấm, trong đó phổ biến nhất là aflatoxin. Hiện nay trên thế giới nhiều tác giả đã tiến hành xây dựng phương pháp định lượng aflatoxin trong nhiều nền mẫu dược liệu khác nhau. Tuy nhiên, trong nước hiện tại các nghiên cứu công bố cho thấy quy trình xử lý mẫu trải qua nhiều công đoạn, tốn nhiều thời gian nên hiệu suất còn chưa được cao. Vì vậy, nhằm đưa ra được phương pháp định lượng aflatoxin trong dược liệu với hiệu suất thu hồi cao và phương pháp đơn giản, cũng như tiết kiệm thời gian hơn, chúng tôi đề xuất đề tài “Xây dựng phương pháp định lượng aflatoxin trong dược liệu bằng LC-MS/MS”, áp dụng để xác định hàm lượng aflatoxin trong một số dược liệu với mục tiêu: - Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng đồng thời 4 độc tố aflatoxin (AFB1, AFB2, AFG1, AFG2) trong dược liệu bằng phương pháp LC-MS/MS sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn với cột ái lực miễn dịch (SPE-IM). - Áp dụng phương pháp đã xây dựng đánh giá mức độc ô nhiễm một số aflatoxin trên các mẫu dược liệu thu mua trên thị trường Hà Nội. 1
- 12. CHƯƠNG 1: TỔNGQUAN 1.1. Tổng quan về aflatoxin 1.1.1. Giới thiệu về aflatoxin Aflatoxin được phát hiện và phân lập lần đầu tiên vào năm 1960 sau sự kiện Bệnh Gà tây X ở Anh làm chết hơn 100.000 con gà tây. Những con gà tây này bị hoại tử gan sau khi được cho ăn lạc mốc và aflatoxin được xác định là nguyên nhân gây bệnh [15,25]. Aflatoxin là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp được sản xuất bởi một vài loại vi nấm, đặc biệt là nấm Aspergillus flavus và Aspergillus paraciticus. Nấm mốc có thể phát triển và sinh aflatoxin trước và sau khi thu hoạch, khi bảo quản cũng như chế biến. Nhiều nông sản có thể bị nhiễm aflatoxin như ngũ cốc, lúa gạo; các loại hạt có dầu như hạt đậu, hạt hướng dương, bông; các loại gia vị như ớt , hạt tiêu, nghệ, gừng; hạnh nhân, quả óc chó và sữa cùng các sản phẩm từ sữa (bơ, pho mát...) [10,20]. Aflatoxin là một nhóm chất gồm các chất có cấu tạo tương tự nhau và đều là dẫn chất của difuranocoumarin, được tổng hợp nhờ con đường polyketide. Ngày nay, người ta đã xác định được khoảng 20 loại aflatoxin trong đó 6 loại aflatoxin quan trọng nhất lần lượt là B1, B2, M1, M2, G1 và G2 [27]. Aflatoxin B1là loại aflatoxin độc nhất và phổ biến nhất, chiếm 60-80% tổng số aflatoxin nhiễm độc trong lương thực, thực phẩm. Thông thường, nếu không có aflatoxin B1 thì cũng sẽ không có AFB2, AFG1 và AFG2 [10,14]. 1.1.2. Tính chất hóa lý Aflatoxin hòa tan trong dung môi phân cực nhẹ như cloroform, methanol, dimethyl sulfoxid. Độ tan của aflatoxin trong nước vào khoảng 10– 20 mg/l. Dung dịch aflatoxin trong dung môi cloroform hay benzen có thể đưuọc trong nhiều năm nếu bảo quản ở điều kiện lạnh và tối [3]. 2
- 13. Ở nhiệt độđun nấu thông thường không thể phân hủy được aflatoxin, nhưng dưới ánh sáng tử ngoại các aflatoxin bị phân hủy. Trong công thức c ấu tạo có vòng lacton nội phân tử, nên các aflatoxin dễ bị phân hủy bởi base mạnh và nếu tiếp tục acid hóa nhẹ thì aflatoxin ban đầu được tái tạ o [3]. Các aflatoxin phát huỳnh quang rất mạnh, dựa vào tính chất này ta có thể phát hiện chúng ở nồng độ rất thấp (trên sắc ký đồ lớp mỏng có thể phát hiện với lượng chất khoảng 0,5ng hay nhỏ hơn). Đây chính là cơ sở hóa lý cho việc phát hiện và định lượng các hợp chất này [3]. 3
- 14. Bảng 1. 1.Tính chất của một vài aflatoxin STT Loại CTPT TLPT Tính chất CTCT TLTK aflatoxin (đvC) - Nhiệt độ nóng chảy 268-269 o C - Huỳnh quang màu xanh da trời. 1 AFB1 C17H12O6 312 - [α]D: -480o (0,1M/dimethyl [22] formamid) - Hấp thụ UV cực đại trong môi trường ethanol: 223; 265; 362 nm. - Nhiệt độ nóng chảy 286-289 o C - Huỳnh quang màu xanh da trời. 2 AFB2 C17H14O6 314 - [α]D: -492o (0,1M/cloroform) [22] - Hấp thụ UV cực đại trong môi trường ethanol: 265; 363 nm. 4
- 15. - Nhiệt độnóng chảy 244-246 o C - Huỳnh quang màu xanh lá cây. 3 AFG1 C17H12O7 328 - [α]D: -556o (0,1M/cloroform) - Hấp thụ UV cực đại trong môi trường ethanol: 243; 257; 264; 362nm. - Nhiệt độ nóng chảy 237- 240 o C - Huỳnh quang màu xanh lá cây. 4 AFG2 C17H14O7 330 - [α]D: -430o (0,084M/cloroform) - Hấp thụ UV cực đại trong môi trường ethanol: 265; 363 nm. - Nhiệt độ nóng chảy 299 o C - Huỳnh quang màu xanh tím. 5 AFM1 C17H12O8 344 - [α]D: -280o (0,1M/dimethyl formamid) - Hấp thụ UV cực đại trong môi trường ethanol: 266; 265; 357 nm. 5 [22] [22] [22]
- 16. 6 AFM2 C17H14O8346 - Nhiệt độ nóng chảy 293 o C - Huỳnh quang màu tím. - Hấp thụ UV cực đại trong môi trường ethanol: 221; 264; 357 nm. [22] 6
- 17. 1.1.3. Điều kiệnsinh aflatoxin Chủng giống: Các loài nấm mốc có thể sinh aflatoxin gồm các loài thuộc chi Aspergillus, thuộc họ nấm cúc: A. flavus, A. arachidicola, A. bombycis, A. minisclerotigenes, A. nomius, A. ochraceoroseus, A. parasiticus, A. pseudotamarii, A. rambellii, trong đó A. flavus và A. parasiticus là hai chủng nấm chủ yếu thường gặp sinh aflatoxin B1 [12]. Hầu hết các chủng nấm Aspergillus sinh trưởng tốt trong điều kiện nhiệt độ 30-35o C và độ ẩm không khí trên 55% trong khoảng pH rộng từ 3-10 trên những cơ chất giàu năng lượng dạng tinh bột [6]. Tuy nhiên, sự có mặ t của chủng nấm mốc sinh aflatoxin không đồng nghĩa với nhiễm aflatoxin do sự tổng hợp aflatoxin còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố vật lý, hóa học và sinh học. Điều kiện môi trường và cơ chất: Các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc và sự hình thành aflatoxin bao gồm: năng lượng (thường dưới dạng tinh bột), vitamin, acid béo, amino acid và chất khoáng, đặc biệt cần có mặt Kẽm (Zn). Vì thế, nhiễm độc aflatoxin thường có trong những sản phẩm nhiều tinh bột, các hạt có dầu như hạt bông, đậu nành tỷ lệ nhiễm ít hơn [14]. Nhiệt độ và độ ẩm cũng ảnh hưởng đến sự tạo thành aflatoxin. Nhiệt độ tối thiểu và tối đa cho tổng hợp aflatoxin theo nghiên cứu lần lượt là 12o C và 42o C. Nhiệt độ tối ưu để hình thành aflatoxin là 25-35o C, nhiệt độ tối ưu để tổng hợ p aflatoxin B1 là 24-28o C. Độ ẩm cần thiết cho tổng hợp aflatoxin của nấm mốc là trên 62%, hàm ẩm nông sản cho tổng hợp aflatoxin tối đa ở nông sản nhiều tinh bột là 18% và trong quả, hạt có dầu là 9-10% [10,14,21]. Như vậy, khí hậu và điều kiện bảo quản ảnh hưởng rất lớn đến sự nhiễm độc aflatoxin trong sản phẩm. Các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới trong đó có Việt nam có khí hậu nóng ẩm, nhiệt độ cao, mưa nhiều phần lớn 7
- 18. thời gian trongnăm, thường có sản phẩm bị nhiễm aflatoxin nhiều hơn so với các nước ôn đới. Các nước đang phát triển như ở khu vực Đông Nam Á, Châu Phi...chưa có nền nông nghiệp hiện đại hóa với những điều kiện trồng trọt và bảo quản chưa đạt tiêu chuẩn làm tăng nguy cơ xuất hiện aflatoxin trong các sản phẩm nông nghiệp nói chung và dược liệu nói riêng. 1.1.4. Cơ chế gây bệnh của aflatoxin Trong số các loại aflatoxin thì AFB1 là loại độc nhất và phổ biến nhất, chiếm 60-80% tổng số aflatoxin nhiễm độc trong lương thực, thực phẩm. AFB1 được chuyển hóa chủ yếu tại gan thành dạng có hoạt tính aflatoxin exo- 8,9-epoxide hoặc hydroxyl hóa thành AFM1 ít độc tính hơn bởi cytochrome P450, một họ enzyme trong tế bào gan. Sự epoxide hóa AFB1 là một bước nguy hiểm gây nguy cơ đột biến gen và ung thư. Aflatoxin exo-8,9-epoxide là một chất rất ái điện tử, không bền vững, nó liên kết ái lực cao với guanine base trong DNA tạo thành aflatoxin-N7-guanine. Aflatoxin-N7-guanine methyl hóa biến G thành T, gây đột biến gen và có thể là nguyên nhân dẫn đến ung thư [13,19]. Aflatoxin exo-8,9 -epoxide và sản phẩm hydrat hóa của nó là dihydrodiol, gắn kết cộng hóa trị với DNA, RNA làm thay đổi cấu trúc và ảnh hưởng chức năng của acid nucleic và protein. Aflatoxin exo-8,9-epoxide còn ức chế enzyme RNA polymerase và ribosomal translocase, ảnh hưởng đến quá trình phiên mã và dịch mã [12]. AFB1 ức chế enzyme glycogen synthetase và transglycosylase làm giảm glycogen ở gan và tăng glucose trong máu. AFB1 ức chế phosphoglucomutase – một enzyme xúc tác thuận nghịch phản ứng chuyển G6P Glucose-6-phosphate thành Glucose-1-phosphate, dẫn đến tích lũy G6P Glucose-6-phosphate và giảm tổng hợp glycogen [12]. 8
- 19. Aflatoxin còn ảnhhưởng đến DNA và cấu trúc ty thể. Aflatoxin-8,9- epoxide ưu tiên gắn vào DNA của ty thể hơn là DNA nhân tế bào cản trở sản xuất ATP làm mất chức năng tổng hợp năng lượng dưới dạng ATP của ty thể và gây tăng chết tế bào theo chương trình (apoptosis) [12,13]. 1.1.5. Độc tính của aflatoxin lên cơ thể người Aflatoxicosis là tình trạng bệnh lý do nhiễm độc aflatoxin, ở người phơi nhiễm với aflatoxin có thể xảy ra aflatoxicosis cấp hoặc mạn tính [9,13]. Độc tính cấp bao gồm: sốt cao, xuất huyết, tổn thương gan cấp với biểu hiện nhiễm độc gan nặng (tỷ lệ tử vong 25%), phù, rối loạn tiêu hóa, rối loạn hấp thu và/hoặc chuyển hóa chất dinh dưỡng, th ậm chí có thể gây tử vong. Aflatoxicosis nguyên phát cấp tính xuất hiện khi phơi nhiễm với lượng trung bình đến lượng lớn aflatoxin [12,14]. Độc tính mạn của aflatoxin B1 do tiêu thụ lượng thấp đến trung bình aflatoxin, thường không có biểu hiện lâm sàng và khó nhận ra. Sau thời gian phơi nhiễm kéo dài, AFB1 có thể gây quái thai và tật nguyền bẩm sinh; đột biến gen làm thay đổi mã gen và DNA, phá vỡ nhiễm sắc thể, tái sắp xếp các mảnh nhiễm sắc thể, tăng thêm hoặc mất hoàn toàn nhiễm sắc thể; gây ung thư trong đó HCC (ung thư biểu mô tế bào gan) là loại ung thư thường gặp do AFB1 [12,14]. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng những thức ăn nhiễm độc AFB1 là yeus tố nguy cơ chính dẫn đến ung thư gan. IARC phân loại AFB1 là tác nhân gây HCC nhóm I [23]. Cơ chế HCC do AFB1 được chứng minh là do đột biến gen p53 – gen ức chế khối u. Một số nghiên cứu tại Trung Quốc và Nam Phi cho thấy có đột biến ở codon 249 (guanine (G) thành thymine (T), kết quả là argenine (R) chuyển thành serine (S)), exon 7 trên gen p53 ở những bệnh nhân HCC [14]. Nguy cơ mắc HCC tăng lên khi đồng phơi nhiễm với AFB1 và virus HBV hoặc HCV [27]. Ở những cá thể có HbsAg dương tính, aflatoxin có tiềm năng gây độc gấp 30 lần ở những người không nhiễm virus. 9
- 20. Nhiễm HBV tăngnguy cơ ung thư gan lên 5 lần trong khi đồng phơi nhiễ m virus HBV và aflatoxin tăng nguy cơ ung thư gan lên 60 lần [17]. Ngoài ra ung thư phổi do AFB1 cũng được báo cáo ở những người phơi nhiễm kéo dài với sản phẩm đã nhiễm độc aflatoxin qua đường hô hấp [19]. AFB1 còn được báo cáo có liên quan đến hội chứng giống như hội chứng Reye ở trẻ em với những triệu chứng như ho, sốt, thay đổi trương lực cơ, nôn. Giải phẫu cho thấy hình ảnh gan to nhiễm mỡ, phù não, thoái hóa mỡ nội tạng, thoái hóa thần kinh. Khi gan bị tổn thương do AFB1 dẫn đến amoniac – sản phẩm chuyển hóa protein và acid amin – không được giải độc khỏi cơ thể, đạt nồng độ cao trong cơ thể, đi qua hàng rào máu não và gây hội chứng não gan [12]. Do có độc tính cao, nhiều quốc gia đã đưa ra các quy định để kiểm soát hàm lượng aflatoxin trong thực phẩm và các sản phẩm nông nghiệp có nguy cơ lây nhiễm cao. Trong Dược điển Trung Quốc 2015 và Dược điển Hồng Kông, quy định giới hạn tổng hàm lượng aflatoxin (AFG1, AFG2, AFB1, AFB2) trong dược liệu không được quá 10 µg/kg và hàm lượng AFB1 không được quá 5 µg/kg. Liên minh châu Âu (EU) quy định tổng hàm lượng aflatoxin không được quá 4 µg/kg và hàm lượng AFB1 không quá 2 µg/kg [18]. Thep FDA, nhiễm độc aflatoxin trong sản phẩm nông nghiệp và dược liệu là khó tránh khỏi, hàng năm có rất nhiều người có nguy cơ phơi nhiễm với aflatoxin. Tuy nhiên, nguy cơ nhiễm độc và độc tính aflatoxin có thể được giảm tớ i mức tối thiểu nhờ các phương pháp kiểm soát và phát hiện aflatoxin trong sản phẩm và dược liệu. 1.1.6. Những nghiên cứu về phương pháp định lượng aflatoxin trong dược liệu 10
- 21. Bảng 1. 2.Một số nghiên cứu định lượng aflatoxin trong và ngoài nước TT Phương pháp Phương Dung môi chiết Điều kiện sắc ký Hoạt chất định TLTK phân tích pháp chiết lượng I Các nghiên cứu trên Thế giớ i Phương + Pha tĩnh: LiChrocart C18 short column pháp chiết (30mm × 4 mm, 3ϻ m) aflatoxin B1, B2, lạnh + methanol : nước + Pha động: methanol – nước 1 LC-MS/MS G1, G2 trên nến mẫu [26] chiết pha (80:20, v/v) (30:70) Rhammus purshiana rắn để làm + Tốc độ dòng: 1mL/phút giàu + Detector phát hiện: ESI (+) - SIM methanol : + Pha tĩnh: Scharlau Chemie C18 aflatoxin B1, B2, Phương nước (70:30, column (250 × 4.6 mm i.d.) G1, G2 trên các nền pháp chiết v/v), methanol: + Pha động: methanol:nước (52:48, v/v) mẫu như Valeriana lạ nh + với 119 mg/L Kali bromide và 100µL/L officinalis, 2 LC-FLD nước (80:20, [16] chiết pha acid nitric 65%. Hypericum v/v) và rắn để làm + Tốc độ dòng: 1,2 mL/phút perforatum, Cassia methanol : giàu + Detector phát hiện: máy dò huỳnh angustifolia, Mentha nitric acid1% quang FP-1520, bước sóng kích thích và pulegium và 11
- 22. (70:30, v/v) phátxạ tương ứng là 365 và 435nm. Chrysanthemum parthenium + Pha tĩnh: Shim-Pack CLC – ODS Column (5µm, 4.6 x 250 mm) Phương + Pha động: dung dịch khử ion hon hợp nước-acetonitrile-methanol (60:20:20, pháp chiết methanol : v/v/v) bổ sung 350 µL HNO3 4M and AFB1 trong thuốc lạnh + 3 LC-FLD nước (85:15, 120 mg KBr. từ thảo dược và [24] chiết pha v/v) + Tốc độ dòng: 1 mL/phút dược liệu rắn để làm + Detector phát hiện: máy dò huỳnh giàu quang Shimadzu LC-10 AD Model, bước sóng kích thích và phát xạ tương ứng là 360 và 435nm. II Các nghiên cứu trong nước Phương + Pha tĩnh: Betabasic 18 (2,0mm x pháp chiết methanol : 50mm, 5ϻm) Các loại aflatoxin 4 LC-MS lạnh + nước (85:15, + Pha động: kênh A: nước; kênh B: [2] trong dược liệu chiết pha v/v) methanol; chạy chế độ Gradient. rắn để làm + Tốc độ dòng: 0,2ml/phút. 12
- 23. giàu + Detectorphát hiện: ESI (+) - SIM Phương + Pha tĩnh: cột C18 Acquity UPLC BEH (2,1x100 mm, 1,7ϻm) pháp chiết + Pha động: kênh A: amoni acetat lạnh + methanol : aflatoxin B1 trong 5 LC-MS 10mM; kênh B: methanol; chạ y chế độ [7] chiết pha nước (6:4, v/v) dược liệu Gradient. rắn để làm + Tốc độ dòng: 0,4 mL/phút giàu + Detector phát hiện: ESI (+) - SIM 13
- 24. Nhận xét: Từ nhữngnghiên cứu trên, ta có thể thấy hiện nay trong nước và trên thế giới nhiều tác giả đã tiến hành xây dựng phương pháp định lượng aflatoxin trong nhiều nền mẫu dược liệu khác nhau. Tuy nhiên, trong nước hiện tại các nghiên cứu công bố cho thấy quy trình xử lý mẫu tr ải qua nhiều công đoạn, tốn nhiều thời gian nên hiệu suất còn chưa được cao. Vì vậy, nhằm đưa ra được phương pháp định lượng aflatoxin trong dược liệu với hiệu suất thu hồi cao và phương pháp đơn giản, cũng như tiết kiệm thời gian hơn, chúng tôi đề xuất đề tài “Xây dựng phương pháp định lượng aflatoxin trong dược liệu bằng LC-MS/MS”, áp dụng để xác định hàm lượng aflatoxin trong một số dược liệu. 14
- 25. 1.2. Tổng quanvề sắc ký ái lực miễn dịch và sắc ký lỏng – khối phổ (LC-MS/MS) 1.2.1. Sắc ký ái lực miễn dịch a) Sắc ký ái lực Sắc ký ái lực là một kỹ thuật sắc ký lỏng sử dụng một thuố c thử liên kết đặc biệt để làm sạch hoặc phân tích các thành phần trong hỗn hợp. Lưu giữ chất phân tích là do tương tác thuận nghịch và chọn lọc của các cặp có trong cơ thể sống như: kháng nguyên – kháng thể, enzyme – cơ chất, hormone – receptor...[1]. Để thực hiện sắc ký ái lực người ta cố đị nh một thành phần của cặp (phối tử - ái lực) trên một chất mang rắn làm pha tĩnh đưa vào cột. Mẫu phân tích có thành phần thứ hai được đưa vào cột nhờ một pha động có pH xác định, lực ion và thành phần dung môi phù hợp gọi là dung dịch đệm rửa giải. Khi mẫu phân tích qua cột, các thành phần khác khuếch tán dễ dàng, chỉ có hai thành phần của cặp tương tác đặc hiệu và liên kết với nhau. Nhờ một dung dịch đệm rửa giải, liên kết trên bị phá vỡ và thành phần chọn lọc với phối tử ái lực đi ra khỏi cột. Phát hiện và định lượng bằng một detector thích hợp [1]. - Phối tử ái lực: là những chất có tính đặc hiệu cao với chất phân tích, quyết định thành công của kỹ thuật tách ái lực. Phối tử ái lực có thể có nguồn gốc sinh học (kháng thể, protein...) hoặc nguồn gốc hóa học (boronat, phức càng cua kim loại...). - Chấ t mang: là những chất rắn được dùng để cố định phối lực ái tử trong cộ t sắc ký. Một số chất mang thường dùng trong sắc ký ái lực là agarose và agarose liên kết, cellulose, silica... b) Sắc ký ái lực miễn dịch Sắc ký ái lực miễn dịch là một loại hình sắc ký ái lực sử dụng phối tử ái lực là kháng thể hoặc kháng nguyên. Do tính đặc hiệu cao của tương tác kháng thể - kháng nguyên và khả năng tạo kháng thể của nhiều loại chất, kỹ 15
- 26. thuật sắc kýái lực miễn dịch trở thành một công cụ phổ biến và quan trọng trong phân tích các chất có nguồn gốc sinh học [1]. Kỹ thuật sắc ký ái lực miễn dịch còn được ứng dụng để tinh chế và làm giàu chất phân tích trong cột chiết pha rắn (SPE) với nhiều ưu điể m [25]: - Sử dụng ít dung môi. - Có tính đặc hiệu cao với chất phân tích. - Làm giàu mẫu cho kết quả phân tích tốt hơn. Nhược điểm của kỹ thuật này là chi phí cao do cột chỉ dùng được một lần (kháng thể bị biến tính) [25]. 1.2.2. Sắc ký lỏng khối phổ a) Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) HPLC là một kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh. Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa hai pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động. Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào các yếu tố đó. Thời gian chất phân tích được rửa giải được ghi lại nhờ detector gọi là thời gian lưu. Thời gian lưu phụ thuộc vào bản chất của chất phân tích và thành phần của pha động và pha tĩnh [1]. Pha tĩnh Trong HPLC, pha tĩnh là các hợp chất được gắn lên chất mang thường là các hạt hình cầu có đường kính 1,5–10 ϻm, có nhiệm vụ tách hỗn hợp chất phân tích. Pha tĩnh có độ phân cực khác nhau, dựa vào độ phân cực của pha tĩnh mà người ta phân ra hai loại: sắc ký pha thuận và sắc ký pha đảo. - Sắc ký pha thuận: pha tĩnh phân cực (các silica có chứa nhóm alkyl ít cacbon mang nhóm chức phân cực –CN, -NH2 ...). - Sắc ký pha đảo: pha tĩnh không phân cực (các silica gắn mạch cacbon dài C18, C8...). Pha động 16
- 27. Pha động trongHPLC là dung môi hoặc hỗn hợp dung môi rửa giải các chất phân tích ra khỏi cột sắc ký. Trong sắc ký pha thuận, pha động là các dung môi ít phân cực như hexan, iso propyl ether..., ngược lại trong sắc ký pha đảo, pha động là các dung môi phân cực như nước, methanol, acetonitril... Có hai cách dùng pha động để rửa giải [1]: - Đẳng dòng: các thành phần pha động không thay đổi trong suốt quá trình chạy sắc ký. - Gradient: tỷ lệ các thành phần dung môi pha động thay đổi trong quá trình chạy sắc ký. Chế độ này phù hợp với mẫu phân tích nhiều thành phần với khả năng phân cực khác nhau, tăng khả năng rửa giải, rút ngắn thời gian phân tích. b) Khối phổ (MS) Nguyên tắc: Khối phổ là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu. Các ion được tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ phận phân tích khối trước khi đến detector. Tất cả các quá trình này diễn ra trong hệ thiết bị chân không: áp suất trong hệ dao động từ 10-3 Pa đến 10-6 Pa. Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng một số vạch (pic) có cường độ khác nhau tập hợp lại thành phổ khối. Nó cung cấp thông tin định tính xác định cấu trúc và định lượng các chất [1]. Máy khối phổ gồm có 5 bộ phận: bộ nạp mẫu, bộ nguồn ion, bộ phân tích khối, detector, bộ xử lý dữ liệu: 17
- 28. Nạp mẫu Hệ chânkhông Nguồn ion Phân tích khối Detector Bơm chân không Xử lý dữ liệu Hình 1.1. Sơ đồ khối của máy khối phổ - Bộ nạp mẫu: là bộ phận đưa mẫu vào máy. Nếu mẫu ở dạng lỏng hoặc rắn cần chuyển sang dạng hơi bằng cách thích hợp. Bộ nạp mẫu có thể phân thành hai nhóm chính là nhóm nạp mẫu trực tiếp và nhóm nạp mẫu gián tiếp. Trong nạp mẫu gián tiếp, bộ nạp mẫu là đầu ra của một thiết bọ phân tích khác được kết nối với khối phổ như sắc ký khí (GC/MS), sắc ký lỏng (LC/MS), điện di mao quản (CE/MS)... - Bộ nguồn ion: trong máy khối phổ, có nhiều cách để ion hóa phân tử và nguyên tử của mẫu ở trạng thái khí hoặc hơi. Một số kỹ thuật thường dùng như ion hóa bằng va chạm electron, ion hóa hóa học, ion hóa bằng tia điện, ion hóa bằng giải hấp...Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng kỹ thuật ion hóa bằng tia điện ESI. K ỹ thuật này tạo ra ion từ phân tử trong dung dịch. Dung dịch ở trong một mao quản kim loại (tốc độ dòng dao động từ 1mL đến 10mL/phút). Người ta đặt một điện trường giữa đầu mao quản và một điện cực, các giọt mịn hạt sương mang điện tích được tạo thành và gia tốc đến điện cực. Kỹ thuật ESI thích hợp để ion hóa các chất phân cực và nghiên cứu các phân tử sinh học có khối lượng phân tử lớn (M ≤ 100000). 18
- 29. - Bộ phântích khối: có nhiệm vụ tách các ion có trị số m/z khác nhau thành từng phần riêng biệt. Tính năng của máy khối phổ chủ yếu phụ thuộc vào bộ phân tích khối. Có 4 loại bộ phân tích khối chính thường được sử dụng: 1. Bộ phân tích từ 2. Bộ phân tích tứ cực 3. Bộ phân tích thời gian bay 4. Bộ phân tích cộng hưởng ion cyclotron Trong phạm vi nghiên cứu này, chúng tôi chỉ đề cập đến bộ phân tích khối tử cực chập ba. Bộ phân tích khối tử cực ch ập ba gồm ba bộ tứ cực nối tiếp nhau. Mỗi bộ gồm 4 cực bằng kim loại đặt song song và sát nhau. Có một khoảng không giữa 4 cực đó để các ion bay qua. Q1 Q2 Q3 Detector Hình 1. 2 . Bộ phân tích tử cực chập ba Q1 sẽ tách các ion; một số ion được chọn lọc từ đây vào Q2. Trong buồng Q2 với áp suất cao, các tiền ion bị phân ly do va chạm với khí trơ có mặt như nitơ, heli, argon, Bộ Q2 tạo ra phân ly do va chạm. Nhờ va chạm này năng lượng động học của các ion chuyển thành nội năng nên chúng bị phan mảnh tiếp tạo ra các ion nhỏ hơn gọi là ion con/ion sản phẩm. Các ion con mới hình thành được dẫn đến Q3 tách riêng và đến detector. Kỹ thuật phân tích khố i phổ kiểu này được gọi là kỹ thuật khối phổ hai lần MS/MS. - Detector: là bộ phận có nhiệm vụ chuyển các ion đã đến thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ. Có 2 dạng detector truyền thống: nhân electron và nhân quang. c) Sắc ký lỏng – khối phổ 19
- 30. Sắc ký lỏng– khối phổ là kỹ thuật sắc ký lỏng có đầu ra kết nối v ới khối phổ. Bộ nguồn ion hóa bằng phun sương khử solvat cho phép chuyền chất phân tích từ pha lỏng sang pha hơi để ion hóa. Phương pháp sắc ký lỏng – khối phổ được ứng dụng nhiều trong phân tích các chất độc và xác định nồng độ thuốc trong cơ thể do có nhiều ưu điểm như [1]: - Cho thông tin về cấu trúc chất phân tích. - Tính chọn lọc cao. - Độ nhạy cao, giới hạn phát hiện có thể đến 10-14 gam nên kỹ thuật này thường được dùng để phân tích hàm lượng siêu vế t. - Có thể phân tích các chất dựa vào tỷ lệ m/z của ion phân tử và ion sản phẩm mà không cần tách hoàn toàn các thành phần trong mẫu có nhiều thành phần. 20
- 31. CHƯƠNG2: ĐỐI TƯỢNGVÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Nền mẫu giàu tinh bột có nguy cơ nhiễm aflatoxin cao nên chúng tôi lựa chọn dược liệu giàu tinh bột như Cát căn, Trạch tả, Hoài sơn,... để xây dựng quy trình định lượng các aflatoxin (AFB1, AFB2, AFG1, AFG2) trong dược liệu. Các mẫu được thu mua trên thị trường Hà Nội. Bảng 2.1. Danh sách các mẫu thu mua STT Tên dược Địa điểm lấy STT Tên dược Địa điểm lấy liệu mẫu liệu mẫu 1 Cát căn 1 Phố Lãn Ông 11 Trạch tả 3 Chợ Ninh Hiệp 2 Cát căn 2 12 Trạch tả 4 3 Cát căn 3 Chợ Ninh 13 Ý dĩ 1 Phố Lãn Ông Hiệp 4 Cát căn 4 14 Ý dĩ 2 5 Bạch linh 1 Phố Lãn Ông 15 Ý dĩ 3 Chợ Ninh Hiệp 6 Bạch linh 2 16 Ý dĩ 4 7 Bạch linh 3 Ch ợ Ninh 17 Hoài sơn 1 Phố Lãn Ông Hiệp 8 Bạch linh 4 18 Hoài sơn 2 9 Trạch tả 1 Phố Lãn Ông 19 Hoài sơn 3 Chợ Ninh Hiệp 10 Trạch tả 2 20 Hoài sơn 4 2.2. Chất chu ẩn, hóa chất và thiết bị 2.2.1. Chất chuẩn Chuẩn Aflatoxin (Supelco, USA): AFB1 (Lot: LB04859); AFB2 (Lot: LB04871); AFG1 ( Lot: LB02201); AFG2 (Lot: LB04861) dạng lỏng có nồng độ 1 ppm. 2.2.2. Hóa chất - Các dung môi dùng cho LCMS: methanol, acetonitril của hãng Merck.
- 32.
- 33. - Các dungmôi, hóa chất dùng để xử lý mẫu methanol, ethanol mua của Trung Quốc và đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích P.A. - Hóa chất tinh khiết phân tích: natri clorid (Merck, Đức). - Nước cất sử dụng là nước cất hai lần đã được deion hóa. 2.2.3. Thiết bị, dụng cụ - Hệ thống máy sắc ký lỏng khối phổ 2 lần LC-MS/MS 8045 của Shimadzu - Cột sắc ký Shimpack C18 (100 x 2,1 mm; 1,9 µm) của Shimadzu - Máy lắc ngang HS 260 (IKA, Đức) - Cột chiết pha rắn Aflatest chứa kháng thể đơn dòng (VICAM, Mỹ) - Bộ dụng cụ chiết pha rắn Visiprep TM 24 (Supelco, Mỹ) - Cân phân tích Mettle Toledo có độ chính xác 0,1mg (Mettle Toledo, Thụy Sĩ) - Cân kỹ thuật XT1200c có độ chính xác 0,01g (Precisa Gravimetry, - Pipet chính xác có thể điều chỉnh thể tích 10-100ϻL và 100-1000ϻL - Ống ly tâm nhựa 50 mL - Vial 1,8 mL - Pipet Pasteur - Giấy lọc. 2.3. Nội dung nghiên cứu 2.3.1. Thu thập mẫu nghiên cứu - Thu thập mẫu Cát căn, Trạch tả, hạt Sen để tiến hành nghiên cứu. - Thái mẫu, sấy mẫu dược liệu ở nhiệt độ 50o C đến khi độ ẩm đạt khoảng 5%. - Bảo quản trong túi kín cho tới khi đưa vào nghiên cứu chiết xuất. 2.3.2. Xây dựng phương pháp định lượng aflatoxin trong dược liệu Nghiên cứu xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích: 22
- 34. - Tối ưuhóa điều kiện khối phổ (MS) - Tối ưu hóa điều kiện sắc ký lỏng - Nghiên cứu phương pháp chiết xuất và làm sạch mẫu với mục đích thu được hàm lượng aflatoxin là lớn nhất. - Thẩm định phương pháp theo hướng dẫn của AOAC 2.3.3. Áp dụng phương pháp đánh giá hàm lượng aflatoxin trong các mẫu dược liệu giàu tinh bột trên thị trường Hà Nội Áp dụng phương pháp đã xây dựng đánh giá mức độc ô nhiễm aflatoxin trên các mẫu dược liệu thu mua trên thị trường Hà Nội. 2.4. Phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp thu thập và xử lý sơ bộ mẫu thử - Thời gian lấy mẫu: Từ 01/10/2018 – 20/04/2023 . - Địa điểm lấy mẫu: chợ Ninh Hiệp, ph ố Lãn Ông. - Khối lượng mẫu: 0,5 kg/mẫu. - Dược liệu được xay nhỏ, đựng trong túi nilon - Bảo quản ở nơi thoáng mát. 2.4.2. Khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc kí - Tối ưu hóa điều kiện khối phổ (MS): Lựa chọn ion mẹ, ion con, các thế Q1, Q2, Q3 thích hợp để thu được tín hiệu phân tích cao nhất. - Tối ưu hóa điều kiện sắc ký lỏng: Thành phần pha động, chương trình gradient. - Nghiên cứu phương pháp chiết xuất và làm sạch mẫu với mục đích thu được hàm lượng aflatoxin là lớn nhất: Khảo sát thành phần dung môi chiết, dung môi loại tạp. 2.4.3. Quy trình thẩm định phương pháp 2.4.3.1. Tính đặc hiệu/ chọn lọc - Khái niệm 23
- 35. Tính đặc hiệu:là khả năng phát hiện chất phân tích khi có mặt các tạp chất khác như: các tiền chất, các chất chuyển hóa, tạp chất. Tính chọn lọc: là khái niệm rộng hơn tính đặc hiệu, liên quan đến việc phân tích một số hoặc nhiều chất chung quy trình. - Xác định: Phương pháp sắc kí lỏng khối phổ Sử dụng phương pháp xác nhận (confirmation method) là một cách rất tốt để đảm bảo tính đặc hiệu của phương pháp. Hội đồng châu Âu quy định cách tính điểm IP (điểm nhận dạng – indenfication point) đối với các phương pháp khác nhau để khẳng định chắc chắn sự có mặ t của một chất. 2.4.3.2. Giới hạn phát hiện (LOD), Giới hạn định lượng (LOQ) - Khái niệm Giới hạn phát hiện (LOD): là nồng độ hoặc khối lượng nhỏ nhất có thể được phát hiện với mức tin cậy xác định. Giới hạn định lượng (LOQ): là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ chính xác mong muốn. - Xác định: Dựa trên tỷ l ệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) Phân tích mẫu ở n ồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích. Xác định tỷ l ệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N). Trong đó: S: Chiều cao tín hiệu của chất phân tích. N: Nhiễu đường nền. LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2-3 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N=3. LOQ được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10-20 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N=10. 2.4.3.3. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn - Khái niệm: 24
- 36. Khoảng tuyến tínhcủa một phương pháp phân tích: là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích. Đường chuẩn: là đường biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ các chất phân tích. - Xác định: Đo các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu và nồng độ. Vẽ đường cong phụ thuộc giữa tín hiệu và nồng độ, sau đó quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính. 2.4.3.4. Độ lặp lại và độ thu hồi Độ lặp lại (độ chụm): là mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ của các phép đo lặp lại và được biểu diễn bằng độ lệch chuẩn S hay độ lệch chuẩn tương đối RSD (%): ( ) ⃐ √ ∑ ( ̅) Trong đó: - xi : Nồng độ tính được của lần thử nghiệm thứ i. - ̅: Nồng độ trung bình tính được của N lần thử nghiệm. - N: Số lần thử nghiệm. Độ đúng của phương pháp: là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa các giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng. 25
- 37. Độ thu hồi(đánh giá độ đúng): là tỷ lệ phần trăm giữa giá trị thu được so với giá trị lý thuyết. ( ) Trong đó: - R: độ thu hồi (%). - C: Nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn (ng/mL). - Cc: Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết) (ng/mL). 2.4.4. Phương pháp xử lý số liệu Các kết quả được tính toán tự động theo phần mềm phân tích của thiết bị (phần mềm LCSolution). Xử lý kết quả bằng phần mềm Microsotf Excel. 26
- 38. CHƯƠNG 3. KẾTQUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Khảo sát điều kiện khối phổ Kỹ thuật FIA (Flow injection analysis) là một kỹ thuật phân tích sử dụng trong HPLC mà không sử dụng cột sắc ký. Ứng dụng trong khảo sát phổ khối, dung dịch chuẩn hỗn hợp chứa AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 có nồng độ mỗi chất 100 ppb được tiến hành tiêm vào hệ thống khối phổ với các điều kiện như sau: - Điều kiện sắc ký: + Pha tĩnh: không lắp cột. + Pha động: ACN: amoni acetat 10 mM (50:50, v/v) + Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút + Thể tích tiêm: 1 uL. - Điều kiện khối phổ: + Nebulizing Gas Flow: 3 L/ phút. + Heating Gas Flow: 10 L/ phút. + Interface Temperature: 300 o C. + DL Temperature: 250o C. + Heat block Temperature: 400o C. + Drying Gas Flow: 10 L/ phút. + Interface Voltage: -5kV đối với ESI-positive Kết qu ả thu được khi quan sát ở chế độ ESI-positive, thấy có mảnh ion mẹ [M+H]+ c ủa AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 có giá trị m/z tương ứng là 313,20; 315,20; 329,15 và 331,15. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu đã được công bố trước đây. 27
- 39. Inten.(x10,000,000) 1.00 313. 20 0.75 329.15 0.50 315.20 0.25 331.15 0.00 307.5 310.0312.5 315.0 317.5 320.0 322.5 325.0 327.5 330.0 332.5 335.0 m/z Hình 3.1. Phổ khối của AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 quan sát dưới chế độ ESI-positive Sau đó tiếp tục áp dụng kỹ thuật FIA để tiến hành tối ưu hóa điều kiện MS/MS tự động. Tiến hành tiêm trực tiế p dung dịch chuẩn hỗn hợp chứa AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 có nồng độ mỗi chất 100 ppb, cài đặt thông số máy để tiến hành tối ưu hóa điều kiện phân mảnh 2 ion con đối với mỗi chất. Kết quả thu được được trình bày trong Bảng 3.1. Bảng 3.1. Thông số MS tối ưu TT Độc tố Ion mẹ Mảnh Dwell Time Q1 (V) CE Q3 [M+H]+ con (msec) (eV) (V) 1 AFB1 313,20 241,05 25 -11,0 -39,0 -23,0 284,95 25 -20,0 -25,0 -25,0 2 AFB2 315,20 286,95 25 -12,0 -25,0 -27,0 259,20 25 -12,0 -33,0 -27,0 3 AFG1 329,15 243,10 25 -24,0 -23,0 -30,0 311,05 25 -23,0 -27,0 -22,0 4 AFG2 331,15 313,00 25 -25,0 -25,0 -29,0 245,00 25 -22,0 -29,0 -23,0 28
- 40. Inten.(x100,000) Inten.(x10,000) 1.0 241.05 2.25 286.95 284.95 0.9 2.00 269.00 0.81.75 0.7 1.50 0.6 1.25 259.20 0.5 243.10 1.00 0.4 0.75 0.3 0.50 0.2 0.1 0.25 0.0 0.00 245.0 250.0 255.0 260.0 265.0 270.0 275.0 280.0 285.0 m/z 245.0 250.0 255.0 260.0 265.0 270.0 275.0 280.0 m/z AFB1 AFB2 Inten.(x10,000) Inten.(x10,000) 5.5 243.10 4.5 313.00 5.0 4.5 4.0 4.0 3.5 3.5 311.05 3.0 245.00 3.0 2.5 2.5 2.0 2.0 1.5 1.5 1.0 1.0 0.5 0.5 0.0 0.0 250 260 270 280 290 300 310 m/z 250 260 270 280 290 300 m/z AFG1 AFG2 Hình 3.2. Phổ khối của ion con các aflatoxin Nhận xét: Trong định lượng bằng phương pháp MRM, ion con có tín hiệu cao hơn thường được l ựa chọn để định lượng hàm lượng của chất phân tích, còn ion con có tín hiệ u thấp hơn được lựa chọn để xác nhận sự có mặt của chất phân tích đó. Kết quả tối ưu hóa thu được cho thấy, các ion con 241,05; 286,95; 243,10 và 313,00 được lựa chọn để định lượng tương ứng AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2. Còn các ion con 284,95; 259,20; 311,05 và 245,00 được l ựa chọn để định tính tương ứng các độc tố này. 3.2. Khảo sát điều kiện sắc ký 3.2.1. Lựa chọn pha tĩnh Qua tham khảo các nghiên cứu trước đây, các tác giả thường sử dụng cột C18 để phân tích các độc tố aflatoxin. Đây cũng là loại pha tĩnh được sử dụng phổ biến trong các phòng thí nghiệm. Các cột pha tĩnh nhồi các hạt có kích thước nhỏ (1,7 µm, 1,9 µm …) và chiều dài cột ngắn cho hiệu lực tách cao cũng như giảm thời gian phân tích. Dựa trên điều kiện phòng thí nghiệm, 29
- 41. chúng tôi lựachọn cột Shimpack C18 (100 x 2,1 mm; 1,9 µm) của Shimadzu để tiến hành khảo sát các điều kiện sắc ký khác. 3.2.2. Khảo sát pha động Trong phương pháp sắc kí lỏng khối phổ, pha động không chỉ ảnh hưởng tới quá trình tách các chất mà nó còn ảnh hưởng tới quá trình ion hóa và tín hiệu của chất phân tích. Với kĩ thuật ion hóa phun điện tử bắn phá ở chế độ ion dương, quá trình ion hóa tăng khi có thêm các chất như acid acetic, acid formic, amoni acetat. Qua tham khảo các nghiên cứu trước đây, các tác giả thường lựa chọn amoni acetat để tiến hành phân tích các aflatoxin. - Các điều kiện sắc ký được giữ cố định như sau: + Pha tĩnh: Shimpack C18 (100 x 2,1 mm; 1,9 µm) + Pha động: Kênh A: ACN; Kênh B: amoni acetat 10 mM + Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút + Thể tích tiêm: 5 uL. + Nhiệt độ cột: 30o C - Điều kiện khối phổ: Như mục 3.1. Chế độ quan sát MRM. Chúng tôi dùng dung dịch chuẩn hỗn h ợp chứa AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 nồng độ mỗi chất10 ppb để tiến hành khảo sát tỷ lệ thành phần pha động với 2 chương trình gradient như sau Bảng 3.2. Một số chương trình gradient khảo sát Gradient 1 Gradient 2 Thờ i gian %ACN Thời gian %ACN (phút) (phút) 0,01 - 1,5 10-30 0,01 - 1,5 30-60 1,5-3 30-90 1,5-3 60-90 3–3,5 90 3–3,5 90 3,5-4 90-10 3,5-4 90-30 4-5,5 10 4-5,5 30 30
- 42. Kết quả thuđược như sau: Hình 3. 3. Sắc ký đồ chương trình gradient 1 Hình 3. 4. Sắc ký đồ chương trình gradient 2 Nhận xét: Với chương trình gradient 1, píc bị chẻ píc và kéo đuối. Với chương trình gradient 2, píc của AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 tương đối 31
- 43. gọn, cân xứngvà giảm hiện tượng chẻ píc. Vì vậy chúng tôi lựa chọn chương trình gradient 2 để tiến hành các khảo sát tiếp theo. Bảng 3. 3. Các thông số sắc ký ứng với chương trình gradient 2 Thông số AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 Hệ số đối xứng (As) 1,077 1,121 1,082 1,203 tR (phút) 3,130 3,038 3,040 2,940 Như vậy, chúng tôi đã khảo sát được điều kiện sắc ký và điều kiện khối phổ như sau: Điều kiện khối phổ: + Nebulizing Gas Flow: 3 L/ phút. + Heating Gas Flow: 10 L/ phút. + Interface Temperature: 300 o C. + DL Temperature: 250o C. + Heat block Temperature: 400o C. + Drying Gas Flow: 10 L/ phút. + Interface Voltage: -5kV. + Chế độ: ESI TT Độc tố Ion mẹ Mảnh Dwell Time Q1 (V) CE Q3 [M+H]+ con (msec) (eV) (V) 1 AFB1 313,20 241,05 25 -11,0 -39,0 -23,0 284,95 25 -20,0 -25,0 -25,0 2 AFB2 315,20 286,95 25 -12,0 -25,0 -27,0 259,20 25 -12,0 -33,0 -27,0 3 AFG1 329,15 311,05 25 -23,0 -27,0 -22,0 243,10 25 -24,0 -23,0 -30,0 4 AFG2 331,15 313,00 25 -25,0 -25,0 -29,0 245,00 25 -22,0 -29,0 -23,0 32
- 44. Điều kiện sắcký: + Pha tĩnh: Shimpack C18 (100 x 2,1 mm; 1,9 µm) + Pha động: Kênh A: ACN; Kênh B: amoni acetat 10 mM + Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút + Thể tích tiêm: 5 uL. + Nhiệt độ cột: 30o C Thời gian 0-1,5 1,5–3 3- 3,5 3,5–4 4– 5,5 (phút) % ACN 30-60 60-90 90 90-30 30 3.3. Khảo sát quy trình xử lý mẫu 3.3.1. Khảo sát dung môi chiết mẫu Trong các nghiên cứu trước đây, các tác giả thường sử dụng hỗn hợp methanol : nước với tỷ lệ 80 : 20 hoặc 75 : 25 để tiến hành phân tích các aflatoxin. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành khảo sát các dung môi chiết mẫu khác nhau nhằm tìm ra điều kiện phụ hợp với phòng thí nghiệm. Quy trình xử lý mẫu như sau: Cân chính xác khoảng 25 g dược liệu vào bình nón dung tích 250 ml. Thêm khoảng 5 g NaCl. Thêm chính xác 100 ml dung môi chiết methanol : nước (với 2 tỷ lệ khảo sát là 80 : 20 và 60 : 40). Lắc ngang trên máy lắc ngang 30 phút. Lọc lấy dịch lọc. Lấy chính xác 10 ml dịch lọc, pha loãng với 40 ml nước. Ly tâm, lấy dịch lọc. Lấy chính xác 10 ml dịch lọc mẫu bên trên. Cho qua cột SPE-IM với tốc độ 1 ml/phút. Rửa tạp bằng 20 ml dung dịch đệm PBS. Rửa giải bằng 1 ml methanol. Lọc qua màng lọc 0,22 µm thu được dung dịch sắc ký. Cả 2 khảo sát đều được tiến hành thêm chuẩn hỗn hợp AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 sao cho dịch chạy sắc ký có nồng độ khoảng 5 ppb. Kết quả được đánh giá trên hiệu suất thu hổi so với dung dịch chuẩn có nồng độ tương ứng. Kết quả được trình bày trong bảng 3.4. 33
- 45. Bảng 3.4. Hiệusuất thu hồi của các aflatoxin với các dung môi khác nhau TT Độc tố Dung môi chiết MeOH : H2O (60 : 40) MeOH : H2O (80 : 20) 1 AFB1 85,1% 87,2% 2 AFB2 75,2% 90,1% 3 AFG1 62,5% 85,6% 4 AFG2 61,2% 84,2% Nhận xét: Khi tiến hành thay đổi dung môi chiết, hiệu suất thu hồi của AFB1 thay đổi không đáng kể, trong khi AFB2, AFG1 và AFG2 có hiệu suất thu hồi cao hơn khi sử dụng dung môi chiết là MeOH : nước (80 : 20). Vì vậy để hiệu suất thu hồi đạt cao nhất chúng tôi lựa chọn dung môi MeOH : nước (80 : 20) để tiến hành các khảo sát tiếp theo. 3.3.2. Khảo sát dung môi làm sạch Khi tiến hành làm sạch dịch chiết bằng cột ái lực miễn dịch SPE-IM, dung môi làm sạch có vai trò quan trọng đối với hiệu suất thu hồi của các chất phân tích. Chúng tôi tiến hành khảo sát các dung môi làm sạch như dung dịch đệm PBS, dung môi MeOH : H2O (5 : 95) và MeOH (10 : 95). Tiến hành xử lý mẫu như mục 3.3.1, d ị ch lọc trước khi làm sạch bằng cột SPE-IM được tiến hành thêm chuẩn AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 sao cho dịch chạy sắc ký có nồng độ kho ảng 5 ppb. Kết quả thu được đánh giá trên hiệu suất thu hồi của chất phân tích so với dung dịch chuẩn có nồng độ tương ứng. Kết quả được trình bày trong bảng 3.5. 34
- 46. Bảng 3.5. Hiệusuất thu hồi của các aflatoxin với các dung môi làm sạch TT Độc tố Dung môi làm sạch PBS MeOH : H2O (5 : 95) MeOH : H2O (25 : 75) 1 AFB1 88,5% 83,5% 80,1% 2 AFB2 89,1% 84,4% 81,2% 3 AFG1 86,2% 80,1% 78,4% 4 AFG2 86,3% 81,2% 75,3% Nhận xét: Kết quả thu được cho thấy, khi sử dụng dung môi làm sạch là MeOH : H2O với tỷ lệ MeOH tăng dần thì hiệu suất thu hồi giảm đi. Vì vậy chúng tôi lựa chọn dung dịch PBS làm dung môi làm sạch. 3.4. Thẩm định phương pháp 3.4.1. Độ chọn lọc của phương pháp Để xác định tính chọn lọc đối với sắc kí khối phổ, chúng tôi sử dụng phương pháp xác nhận. Hội đồng châu Âu quy định cách tính điểm IP (điểm nhận dạng – indenfication point) đối với sắc ký lỏng khối phổ 2 lần (LC- MS/MS) là 4. Tức là cần có 1 ion mẹ bắn phá ra 2 ion con. Bảng 3.6. Ion mẹ và ion con của aflatoxin TT Độc tố Ion mẹ Ion con Vai trò Số điểm IP [M+H]+ 1 AFB1 313,20 241,05 Định lượng 4 284,95 Định tính 2 AFB2 315,20 286,95 Định lượng 4 259,20 Định tính 3 AFG1 329,15 243,10 Định lượng 4 311,05 Định tính 4 AFG2 331,15 313,00 Định lượng 4 245,00 Định tính 35
- 47. Như vậy phươngpháp có tính đặc hiệu đáp ứng yêu cầu. Để xác định chắc chắn phương pháp có tính đặc hiệu cao, chúng tôi đã tiến hành phân tích mẫu trắng, mẫu thử thêm chuẩn và mẫu chuẩn. Kết quả cho thấy mẫu trắng không cho các mảnh m/z của chất phân tích. Trên sắc đồ mẫu th ử xuất hiện các píc của AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 có thời gian lưu trùng khớp với thời gian lưu trên mẫu chuẩn. Như vậy, phương pháp có tính đặc hiệu cao. A. Mẫu thử thêm chuẩn B. Mẫu chuẩn C. Mẫu trắng Hình 3.5. Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp 3.4.2. Tính phù hợp hệ thống Để xác định tính phù hợp hệ thống của phương pháp, chúng tôi tiến hành sắc ký 6 lần dung dịch hỗn hợp chuẩn AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 có nồng độ là 5 ppb với điều kiện đã khảo sát. Tiến hành ghi lại thời gian lưu và diện tích píc tương ứng. Kết quả thu được như Bảng 3.7. 36
- 48. Bảng 3.7. Kếtquả đánh giá độ thích hợp hệ thống của phương pháp AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 TT tR S píc tR S píc tR S píc tR S píc (phút) (mAu.s) (phút) (mAu.s) (phút) (mAu.s) (phút) (mAu.s) 1 3,130 44067 3,035 22233 3,047 41642 2,954 26136 2 3,131 45179 3,031 24103 3,045 42011 2,955 26269 3 3,135 44906 3,037 23211 3,057 42099 2,956 27016 4 3,137 46022 3,031 23089 3,042 44013 2,949 25076 5 3,139 47031 3,033 24093 3,041 41098 2,951 28031 6 3,136 45056 3,039 23093 3,050 43072 2,956 27904 TB 3,135 45376 3,034 23303 3,047 42322 2,954 26738 SD 0,004 1022,93 0,003 708,15 0,006 1051,57 0,003 1136,07 RSD(%) 0,11 2,25 0,11 3,04 0,19 2,48 0,10 4,25 Nhận xét: Kết quả cho thấy độ lệch chuẩn tương đối của diện tích píc và thời gian lưu của các aflatoxin đều nhỏ hơn 5,0%, cho thấy các điều kiện sắc ký đã lựa chọn và hệ thống LC-MS/MS sử dụng là phù hợp và đảm bảo độ ổn định của phép phân tích định lượng aflatoxin. 3.4.3. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính Để xây dựng khoảng tuyến tính và đường chuẩn. Chúng tôi tiến hành chuẩn bị 1 dãy dung dịch chuẩn aflatoxin với khoảng nồng độ từ 0,1 – 10 ppb. Tiến hành sắc ký với điều kiện đã khảo sát. Ghi lại tín hiệu píc và tiến hành xây dựng mối tương quan giữa nồng độ và diện tích píc. Kết quả khảo sát sự tương quan giữa diện tích píc và nồng độ aflatoxin trình bày trong Bảng 3.8. 37
- 49. Bảng 3.8. Quanhệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích píc của các chất AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 Nồng S píc Nồng S píc Nồng S píc Nồng S píc độ độ độ độ (mAU.s) (mAU.s) (mAU.s) (mAU.s) (ppb) (ppb) (ppb) (ppb) 0,1 2012 0,5 4812 0,1 2181 0,5 5771 0,5 10990 1 9922 0,5 10254 1 14652 1 19686 2,5 22233 1 19990 2,5 26136 2,5 44067 5 52060 2,5 41642 5 50601 5 105197 10 116191 5 94393 10 91849 10 185637 10 184789 Y = 18795x + Y = 8891,2x Y = 18475x + Y = 11779x - 1434,6 +4015,3 63,89 37178 R2 = 0,9949 R2 = 0,9967 R2 = 0,9989 R2 = 0,9967 38
- 50. Đường chuẩn củaAFB1 200000 y = 18795x + 1434.6 150000 R² = 0.9949 100000 50000 0 0 5 10 15 Nồng độ (ppb) Diện tích píc Đường chuẩn AFB2 100000 80000 y = 8891.2x + 4015.3 R² = 0.9967 60000 40000 20000 0 0 5 10 15 Nồng độ (ppb) Đường chuẩn của AFG1 200000 150000 y = 18475x + 63.89 R² = 0.9989 100000 50000 0 0 5 10 15 Nồng độ (ppb) Diện tích píc Đường chuẩn của AFG2 140000 120000 y = 11779x - 3717.8 100000 R² = 0.9956 80000 60000 40000 20000 0 0 5 10 15 Nồng độ (ppb) Hình 3.6. Đườ ng chuẩn của các độc tố aflatoxin Nhận xét: Đường chuẩn được đánh giá thông qua hệ số tương quan R2 . Kết quả đánh giá đường chuẩn được trình bày trong Bảng 3. cho thấy R2 lớn hơn 0,99 cho thấy đường chuẩn được xây dựng có độ tuyến tính cao đảm bảo để thực hiện phép phân tích định lượng các aflatoxin. 3.4.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) Để đánh giá LOD và LOQ của phương pháp, chúng tôi thêm chuẩn vào mẫu thử không chứa chất phân tích sao cho mức nồng độ cuối cùng ở mức 5 ppb. Sau đó tiến hành pha loãng trên nền mẫu thực không chứa chất phân tích và phân tích đến khi thu được chiều cao chất phân tích gấp 3 lần tín hiệu đường nền. Từ đó xác định LOD và LOQ. Kết quả thu được như Bảng 3.9. 39
- 51. Bảng 3.9. Kếtquả xác định LOD và LOQ của phương pháp AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 LOD (µg/kg) 0,010 0,020 0,015 0,025 LOQ (µg/kg) 0,033 0,066 0,045 0,075 3.4.5. Độ lặp lại và độ thu hôi Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp được đánh giá bằng cách phân tích các mẫu trắng thêm chuẩn ở các mức nồng độ khác nhau 50, 100, 150 ng/mL (tương ứng 500, 1000, 1500 µg/kg trên mẫu), phân tích lặp lại 6 lần cho mỗi nồng độ. Các kết quả tính độ lệch chuẩn tương đối và độ thu hồi được trình bày trong bảng 3.12. 40
- 52. Bảng 3.10. Độlặp lại và độ thu hồi của aflatoxin trên nền mẫu dược liệu Mức Nồng độ (ppb) Độ thu hồi (%) thêm Mẫu AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 chuẩn TT-1 1,21 1,12 1,33 1,26 96,8 89,6 106,4 100,8 2,5 TT-2 1,20 1,41 1,35 1,35 96,0 112,8 108,0 108,0 TT-3 1,19 1,02 1,05 1,37 95,2 81,6 84,0 109,6 µg/kg TT-4 1,35 1,11 1,43 1,09 108,0 88,8 114,4 87,2 tương ứng TT-5 1,09 1,09 1,11 1,13 87,2 87,2 88,8 90,4 1,25 TT-6 1,42 1,31 1,34 1,39 113,6 104,8 107,2 111,2 ppb TB 1,24 1,18 1,27 1,27 SD 0,11 0,14 0,14 0,12 RSD(%) 8,81 11,61 10,89 9,28 TT-1 2,32 2,43 2,47 2,33 92,8 97,2 98,8 93,2 TT-2 2,46 2,16 2,59 2,34 98,4 86,4 103,6 93,6 5 TT-3 2,39 2,33 2,23 2,17 95,6 93,2 89,2 86,8 µg/kg TT-4 2,22 2,37 2,34 2,29 88,8 94,8 93,6 91,6 tương TT-5 2,09 2,19 2,21 2,47 83,6 87,6 88,4 98,8 ứng TT-6 2,04 2,12 2,25 2,52 81,6 84,8 90,0 100,8 2,5 ppb TB 2,25 2,27 2,35 2,35 SD 0,17 0,13 0,15 0,13 RSD(%) 7,40 5,59 6,49 5,37 TT-1 3,71 3,65 3,47 3,44 98,9 97,3 92,5 91,7 TT-2 3,55 3,45 3,79 3,67 94,7 92,0 101,1 97,9 7,5 TT-3 3,35 3,49 3,55 3,73 89,3 93,1 94,7 99,5 µg/kg TT-4 3,79 3,67 3,89 3,53 101,1 97,9 103,7 94,1 tương TT-5 3,42 3,51 3,65 3,69 91,2 93,6 97,3 98,4 ứng TT-6 3,84 3,93 3,74 3,45 102,4 104,8 99,7 92,0 3,75 ppb TB 3,61 3,62 3,68 3,59 SD 0,20 0,18 0,16 0,13 RSD(%) 5,58 4,90 4,24 3,56 Nhận xét: Theo quy định của AOAC, phần trăm tìm lại tại khoảng nồng độ 1 – 5 µg/Kg đạt trong khoảng 40 – 120% và RSD(%) ≤ 30 [3]. Kết quả thu được có độ đúng từ 81,6 - 113,6% và RSD(%) từ 3,56 - 11,61%
- 53.
- 54. chứng tỏ phươngpháp có độ chính xác cao, độ lặp lại tốt khi phân tích các aflatoxin trong dược liệu. 3.5. Áp dụng phương pháp đánh giá hàm lượng aflatoxin trong dược liệu Áp dụng phương pháp đã xây dựng, tiến hành đánh giá hàm lượng aflatoxin trong các mẫu dược liệu giàu tinh bột thu mua trên thị trường Hà Nội. Mỗi mẫu được tiến hành lặp lại 3 lần độc lập. Kết quả như Bảng 3.11. Bảng 3.11. Kết quả hàm lượng aflatoxin trên các mẫu dược liệu giàu tinh bột STT Tên dược Địa điểm lấy AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 liệu mẫu (µg/kg) (µg/kg) (µg/kg) (µg/kg) 1 Cát căn 1 Phố Lãn Ông (-) (-) (-) (-) 2 Cát căn 2 (-) (-) (-) (-) 3 Cát căn 3 Chợ Ninh (-) (-) (-) (-) Hiệp 4 Cát căn 4 (-) (-) (-) (-) 5 Bạch linh 1 Phố Lãn Ông (-) (-) (-) (-) 6 Bạch linh 2 (-) (-) (-) (-) 7 Bạch linh 3 Ch ợ Ninh (-) (-) (-) (-) Hiệp 8 Bạch linh 4 (-) (-) (-) (-) 9 Trạch tả 1 Phố Lãn Ông (-) (-) (-) (-) 10 Trạch tả 2 (-) (-) (-) (-) 11 Trạ ch tả 3 Chợ Ninh (-) (-) (-) (-) Hiệp 12 Trạ ch tả 4 (-) (-) (-) (-) 13 Ý dĩ 1 Phố Lãn Ông (-) (-) (-) (-) 14 Ý dĩ 2 (-) (-) (-) (-) 15 Ý dĩ 3 Chợ Ninh (-) (-) (-) (-) Hiệp 16 Ý dĩ 4 0,37 (-) 0,60 (-) 17 Hoài sơn 1 Phố Lãn Ông (-) (-) (-) (-)
- 55.
- 56. 18 Hoài sơn2 (-) (-) (-) (-) 19 Hoài sơn 3 Chợ Ninh (-) (-) (-) (-) Hiệp 20 Hoài sơn 4 (-) (-) (-) (-) *Ghi chú: (-) : Không phát hiện chất phân tích Nhận xét: Kết quả thu được cho thấy hầu hết các mẫu dược liệu thu mua trên địa bạn Hà Nội đều không phát hiện aflatoxin. Mẫu YD4 được thu mua tại chợ Ninh Hiệp có phát hiện AFB1 và AFG1 hàm lượng lần lượt là 0,37 và 0,60 µg/kg. 43
- 57. CHƯƠNG 4. KẾTLUẬN Như vậy, nhóm nghiên cứu đã tiến hành xây dựng và thẩm đị nh phương pháp định lượng các aflatoxin (AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2) trong dược liệu với quy trình phân tích như sau: Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 25 g dược liệu vào bình nón dung tích 250 ml. Thêm khoảng 5 g NaCl. Thêm chính xác 100 ml dung môi chiết methanol : nước tỷ lệ 80 : 20. Lắc ngang trên máy lắc ngang 30 phút. Lọc lấy dịch lọc. Lấy chính xác 10 ml dịch lọc, pha loãng với 40 ml nước. Ly tâm, lấy dịch lọc. Lấy chính xác 10 ml dịch lọ c mẫu bên trên. Cho qua cột SPE-IM với tốc độ 1 ml/phút. Rửa tạp bằng 20 ml dung dịch đệm PBS. Rửa giải bằng 1 ml methanol. Lọc qua màng lọc 0,22 µm thu được dung dịch sắc ký. + Nebulizing Gas Flow: 3 L/ phút. + Heating Gas Flow: 10 L/ phút. + Interface Temperature: 300 o C. + DL Temperature: 250o C. + Heat block Temperature: 400o C. + Drying Gas Flow: 10 L/ phút. + Interface Voltage: -5kV. + Chế độ: ESI TT Độc tố Ion mẹ Mảnh Dwell Time Q1 (V) CE Q3 [M+H]+ con (msec) (eV) (V) 1 AFB1 313,20 241,05 25 -11,0 -39,0 -23,0 284,95 25 -20,0 -25,0 -25,0 2 AFB2 315,20 286,95 25 -12,0 -25,0 -27,0 259,20 25 -12,0 -33,0 -27,0 3 AFG1 329,15 311,05 25 -23,0 -27,0 -22,0 243,10 25 -24,0 -23,0 -30,0 4 AFG2 331,15 313,00 25 -25,0 -25,0 -29,0 245,00 25 -22,0 -29,0 -23,0 44
- 58. Điều kiện sắcký: + Pha tĩnh: Shimpack C18 (100 x 2,1 mm; 1,9 µm) + Pha động: Kênh A: ACN; Kênh B: amoni acetat 10 mM + Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút + Thể tích tiêm: 5 uL. + Nhiệt độ cột: 30o C Thời gian 0-1,5 1,5–3 3- 3,5 3,5–4 64– 5,5 (phút) % ACN 30-60 60-90 90 90-30 30 - Nhóm nghiên cứu đã tiến hành định lượng aflatoxin trong các mẫu dược liệu giàu tinh bột (Cát căn, Hoài sơn, Ý dĩ, Trạch tả, Bạch linh) thu mua tại một số cửa hàng dược liệu trên thị trường Hà Nội. Kết quả thu được cho thấy hầu hết các mẫu dược liệu đều không phát hiện aflatoxin. Trong đó có mẫu YD4 phát hiện hàm lượng AFB1 và AFG1 lần lượt là 0,37 và 0,60 µg/kg. Mức này thấp hơn so với quy định trong Dược điển Hồng Kông (Hàm lượng AFB1 không quá 5 µg/kg và tổng hàm lượng AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 không quá 10 µg/kg). Kiến nghị: 1. Mở rộng đối tượng nghiên cứu trên các nền mẫu khác, nghiên cứu các độc tố vi nấm khác trong dược liệu. 2. Khảo sát số lượng mẫu lớn hơn để sàng lọc các đối tượng dược liệu có tỷ lệ nhiễm aflatoxin cao. 3. Khảo sát sâu các dược liệu có nguy cơ nhiễm aflatoxin cao để có phương hướng khắc phục, xử lý. 45
- 59. TÀI LIỆU THAMKHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. GS.TS Trần Từ An (2007), Hóa phân tích, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr.107-316. 2. Nguyễn Thị Kim Ánh (2008), Nghiên cứu phân tích độc tố nấm Aflatoxin trong dược liệu bằng sắc ký lỏng khối phổ LC-MS, Khóa luận tốt nghiệp, Trường Đại học Dược Hà Nội. 3. Bộ môn Hóa phân tích (2006), Môi trường và độc chất môi trường, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr.142-147. 4. Bộ Y tế (2011), Thông tư Ban hành các Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với giới hạn ô nhiễm hóa học trong th ực phẩm, Số 02/2011/TT-BYT, tr.20-22. 5. Lê Thị Hồng Hảo (2014), Khảo sát mức độ nhiễm mycotoxin trong ngô và lạc tại tỉnh Bắc Giang, Luận văn tốt nghiệp Dược sĩ, Đại học Dược Hà Nội, tr.18-19. 6. GS.TS Từ Quang Hiển, GS.TS Đậu Ngọc Hào, TS Lê Thị Ngọc Diệp, TS Từ Trung Kiên (2012), Độ c tố trong thức ăn chăn nuôi, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội, tr.8-10. 7. Phan Thanh Lam (2016), Đánh giá hàm lượng afaltoxin B1 trong một số loại dược liệu, Khóa luận tốt nghiệp, Trường Đại học Dược Hà Nội. 8. Nguyễn Đình Nga, Nguyễn Thị Kiều Khanh, Văn Phố (2012), “Khảo sát mức độ nhi ễ m nấm và aflatoxin B1 (AFB1) trên một số mẫu dược liệu được bán ở quận 5-thành phố Hồ Chí Minh”, Y Học TP Hồ Chí Minh, tập 16, số 1, tr.93-96. 9. TS. Trần Cao Sơn (2010), Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật, Nhà xuất bản Khoa Học và Kỹ Thuật, Hà Nội, tr.5-35. 46
- 60. 10. Nguyễn TườngVy, Trần Việt Hùng (2012), “Nghiên cứu phân tích afaltoxin trong dược liệu bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC/MS)”, Nghiên cứu dược và thông tin thuốc, Số 2, tr.5-55. Tài liệu tiếng Anh 11. Agag BI (2004), “Mycotoxins in foods and feeds: 1-aflatoxins”, Univ Bull Env Res, Vol 7(1), pp.173-205. 12. Bbosa GS, A. Lubega, David B. Kyegombe, David Kitya, Jasper Ogwal- Okeng, William W. Anokbonggo (2013), “Review of the biological and health effects of aflatoxins on body organs and body system”, Aflatoxins-Recent Adv Future Prospects, pp.239-256. 13. Bbosa GS, Kitya D, Odda J, Ogwal -Okeng J (2013), “Aflatoxins metabolism, effects on epigenetic mechanisms and their role in carcinogenesis”, Health, tập 5, pp.14-34. 14. D. Dhanasekaran, A. Panneerselvam, N. Thajuddin, S. Shanmugapriya (2011), “Aflatoxins and aflatoxicosis in human and animals”, Aflatoxins – Biochem Mol Biol, INTECH, pp.221-244. 15. Goldblatt L (2012), Aflatoxin: scientific background, control, and implications, Elsevier, Dutch. 16. Gómez‐ Catalán, J. Piqué, E. Falcó, G. Borrego, N. Rodamilans, M. & 17. Hamid AS, Tesfamariam IG, Zhang Y, Zhang ZG (2013), “Aflatoxin B1- induced hepatocellular carcinoma in developing countries: Geographical distribution, mechanism of action and prevention (Review)”, Oncology Letter, Vol 5(4), pp.1087-1092. 18. Hong Kong Chinese Materia Media Standards (HKCMMS) Oficce, "Determination of Mycotoxin (Aflatoxins)", Vol 4, pp.29-30. 47
- 61. 19. Humans IWGon the E of CR to, Organization WH, Cancer IA for R on (2002), Some traditional herbal medicines, some mycotoxins, naphthalene and styrene, World Health Organization. 20. Laura Mejía-Teniente, Angel María Chapa-Oliver, Irineo Torres- Pacheco, Moises Alejandro Vazquaez-Cuz, Ramón Gerardo Guevara- González (2011), “Aflatoxins Biochemistry and Molecular Biology – Biotechnological Approaches for Control in Crops”, Aflatoxins – Detect Meas Control, INTECH Open Access Publisher, pp.317-343. 21. Magda Carvajal, Pasvel Castillo (2002), “Effects of aflatoxins contaminating food on human health”, Trop Biol Conserv Manag, Số 3, pp.1-6. 22. Merk index (2001), Vol 1, pp.34-35. 23. Jonathan H. Williams, Timothy D. Phillips, Pauline E. Jolly, Jonathan K. Stiles, Curtis M. Jolly, Deepak Aggarwal (2004), “Human aflatoxicosis in developing countries: a review of toxicology, exposure, potential health consequences and interventions”, Am J Clin Nutr, Số 80.(5), pp.1106- 1122. 24. Prado, G., Altoé, A. F., Gomes, T. C., Leal, A. S., Morais, V. A., Oliveira, M. S., ... & Silva, D. A. (2012), “Occurrence of aflatoxin B1 in natural products”, Brazilian Journal of Microbiology, 43(4), pp.1428- 1435. 25. Turner NW, Sreenath Subrahmanyam, Sergy A. Piletsky (2009), “Analytical methods for determination of mycotoxins: a review”, Analytica Chimica Acta, Số 632.(2), pp.168-180. 26. Ventura, M. Gómez, A. Anaya, I. Díaz, J. Broto, F. Agut, M. & Comellas, L. (2004), “Determination of aflatoxins B1, G1, B2 and G2 in medicinal herbs by liquid chromatography–tandem mass spectrometry”, Journal of Chromatography A, 1048(1), pp.25-29. 48
- 62. 27. Wu F,Stacy SL, Kensker TW (2013), “Global risk assessment of aflatoxins in maize and peanuts: Are regulatory standards adequately protective?”, Toxicol Sci, Số 135.(1), pp.251-259. 49
- 63. PHỤ LỤC Dung dịchchuẩn AFB1 1:AFB1 313.20>241.05(+) CE: -39.0 55000 50000 45000 40000 35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0 0.0 0.5 1.0 1.5 1:AFB1 313.20>241.05(+) CE: -39.0 35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0 0.0 0.5 1.0 1.5 185637 5 2 8 2.0 2.5 3.0 3.5 4. 0 4.5 5.0 min Nồng độ 10 ppb 105197 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min Nồng độ 5 ppb 3:AFG1 329.15>243.10(+) CE: -27.0 4 1 7 4 5 12500 10000 7500 5000 2500 0 53145 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min
- 64. Nồng độ 2,5ppb 1:AFB1 313.20>241.05(+) CE: -39.0 1968 6 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 130 8 9 256 1 7 3 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min Nồng độ 1 ppb 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 1:AFB1 313.20>241.05(+) CE: -39.0 10990 500 8 9 0 0.0 0.5 1.0 1.5 1:AFB1 313.20>241.05(+) CE: -39.0 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min Nồng độ 0,5 ppb 2012 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min
- 65. Nồng độ 0,1ppb Dung dịch chuẩn AFB2 2:AFB2 315.20>286.95(+) CE: -25.0 125000 100000 75000 50000 9 1 7 4 1 25000 12103 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min Nồng độ 10 ppb 70000 2:AFB2 315.20>286.95(+) CE: -25.0 60000 50000 40000 30000 20000 5 0 6 0 1 10000 7022 66 1 3 3 1 2 2 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min Nồng độ 5 ppb 2:AFB2 315.20>286.95(+) CE: -25.0 30000 25000 20000 15000 10000 2 6 1 3 6 5000 0 290 3852 316 902 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min
- 66. Nồng độ 2.5ppb 2:AFB2 315.20>286.95(+) CE: -25.0 15000 12500 10000 7500 5000 14652 2500 0 1 6 5 2 0 7 1 5 4 11 1 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min Nồng độ 1 ppb 2:AFB2 315.20>286.95(+) CE: -25.0 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 0.00.51.01.5 Dung dịch chuẩn AFG1 125000 3:AFG1 329.15>243.10(+) CE: -27.0 100000 75000 50000 25000 0 0.0 0.5 1.0 1.5 5771 809 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min Nồng độ 0,5 ppb 185161 173 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min
- 67. Nồng độ 10ppb 110000 3:AFG1 329.15>243.10(+) CE: -27.0 100000 90000 80000 70000 60000 50000 40000 94393 30000 20000 10000 591 0 0. 0 0. 5 1. 0 1. 5 2. 0 2. 5 3. 0 3. 5 4. 0 4. 5 5. 0 min Nồng độ 5 ppb 55000 3:AFG1 329.15>243.10(+) CE: -27.0 50000 45000 40000 35000 30000 25000 20000 41745 15000 10000 5000 35145 0 0. 0 0. 5 1. 0 1. 5 2. 0 2. 5 3. 0 3. 5 4. 0 4. 5 5. 0 min Nồng độ 2,5 27500 3:AFG1 329.15>243.10(+) CE: -27.0 25000 22500 20000 17500 15000 12500 10000 19990 7500 5000 2500 738 311 166 130 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min
- 68. Nồng độ 1ppb 3:AFG1 329.15>243.10(+) CE: -27.0 12500 10000 7500 5000 10254 2500 0 9 4 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4. 0 4.5 5.0 min Nồng độ 0.5 ppb 3:AFG1 329.15>243.10(+) CE: -27.0 7000 6000 5000 4000 3000 2000 2181 1000 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min Nồng độ 0.1 ppb Dung dịch chuẩn AFG2
- 69. 4:AFG2 331.15>313.00(+) CE:-25.0 40000 35000 30000 25000 66040 20000 15000 10000 5000 0 289 23 4 264 2 5 6 0. 0 0. 5 1. 0 1. 5 2. 0 2. 5 3. 0 3. 5 4. 0 4. 5 5. 0 min Nồng độ 10 ppb 4:AFG2 331.15>313.00(+) CE: -25.0 60000 50000 40000 30000 20000 52060 10000 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2. 0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min Nồng độ 5 ppb 4:AFG2 331.15>313.00(+) CE: -25.0 25000 22500 20000 17500 15000 12500 10000 7500 2259 9 5000 2500 259 307 36330 6 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min Nồng độ 2.5 ppb
- 70. Nồng độ 1ppb Nồng độ 0.5 ppb SẮC KÝ ĐỒ MẪU THỬ Mẫu phát hiện Mẫu YD4 3:AFG1 329.15>243.10(+) CE: -27.0 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 4890 500 1 7 9 244 254 1 9 9 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min AFG1
- 71. 4:AFG2 331.15>313.00(+) CE:-25.0 600 500 400 300 200 100 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min AFG2 3000 1:AFB1 313.20>241.05(+) CE: -39.0 2500 2000 1500 5639 1000 500 0 100 67 6716 7 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min AFB1 1750 2:AFB2 315.20>286.95(+) CE: -25.0 1500 1250 1000 750 500 250 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min AFB2 Mẫu không phát hiện Mẫu BL1
- 72. 200 1:AFB1 TIC(+) 175 150 125 100 75 50 25 0 0.00.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min 250 2:AFB2 TIC(+) 225 200 175 150 125 100 75 50 25 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min 3:AFG1 TIC(+) 1500 1250 1000 750 500 250 0 0.0 0. 5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min
- 73. 2750 4:AFG2 TIC(+) 2500 2250 2000 1750 1500 1250 1000 750 500 250 0 0.00.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min Mẫu TT1 1:AFB1 TIC(+) 2250 2000 1750 1500 1250 1000 750 500 250 0 0.0 0. 5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min
- 74. 500 2:AFB2 TIC(+) 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0.00.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min 3:AFG1 TIC(+) 2000 1750 1500 1250 1000 750 500 250 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min 4:AFG2 TIC(+) 1500 1250 1000 750 500 250 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min Mẫu CC1
- 75. 1:AFB1 TIC(+) 700 600 500 400 300 200 100 0 0.0 0.51.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min 2:AFB2 TIC(+) 300 250 200 150 100 50 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min 3:AFG1 TIC(+) 1500 1250 1000 750 500 250 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min
- 76. 12500 10000 4:AFG2 TIC(+) 7500 5000 2500 0 0.0 0.51.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min Mẫu HS1 2250 1:AFB1 TIC(+) 2000 1750 1500 1250 1000 750 500 250 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2. 0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min 600 2:AFB2 TIC(+) 500 400 300 200 100 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min
- 77. 2250 3:AFG1 TIC(+) 2000 1750 1500 1250 1000 750 500 250 0 0.0 0.51.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min 4:AFG2 TIC(+) 11000 10000 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min