Download to read offline
![76
0,004μg/ml đối với kỹ thuật ngọn lửa. Đối với kỹ thuật không ngọn lửa thì đạt độ nhạy
0,008μg/ml, giới hạn phát hiện 0,002μg/ml.
5.1.4.5. Các phương pháp điện hoá
Cadimi có thể xác định bằng phương pháp cực phổ. Nguyên tắc của phương
pháp này dựa trên sự khử ion Cd2+
trong môi trường axit, trung tính hoặc kiềm. Trong
một khoảng nồng độ nhất định của Cd2+
thì cường độ dòng khuyếch tán (hay chiều cao
sóng cực phổ) tỷ lệ với nồng độ Cd2+
theo phương trình Incovich: I = k.C.
Phương pháp điện hoá được sử dụng phổ biến hiện nay là phương pháp von-
ampe hòa tan anot là một phương pháp xác định cadimi có độ nhạy cao. Đây là
phương pháp vừa xác định vừa làm giàu chất phân tích. Trước tiên cadimi được điện
phân làm giàu lên điện cực làm việc ở thế không đổi. Sau đó hòa tan Cd bằng cách
phân cực ngược anốt rồi ghi lại đường cong von-ampe hòa tan của cadimi.
Khi xác định cadimi theo phương pháp cực phổ nếu trong mẫu nước hàm
lượng Cu không cao thì có thể xác định đồng thời hai nguyên tố, nếu hàm lượng đồng
lớn thì cần che bằng xianua.
5.1.4.6. Các phương pháp khác
- Phương pháp đo độ đục: dùng phản ứng của cadimi với Fe[(CN)6]4-
hoặc với
triphenyl metyl arsoni iodua. Độ nhạy của phương pháp đến 2,3μg/ml.
- Phương pháp kích hoạt notron: sử dụng cadimi-114 (giới hạn phát hiện là
30μg) và cadimi-116( giới hạn phát hiện là 0,7μg).
Các phương pháp xác định hàm lượng KLN rất đa dạng, tuy nhiên, trong điều
kiện phòng thí nghiệm hiện nay, chúng tôi chọn phương pháp Von-Ampe hòa tan xung
vi phân dùng điện cực màng Hg điều chế tại chỗ trên điện cực rắn đĩa quay glassy
carbon. Tuy nhiên, cho dù sử dụng phương pháp nào đi chăng nữa thì con người và kỹ
thuật, kinh nghiệm phân tích vẫn là yếu tố quyết định độ chính xác của phép đo.
Sau đây là một số ví dụ xác định hàm lượng kim loại nặng.
5.2. Xác định các kim loại: đồng, chì, kẽm bằng phương pháp Dithizon
5.2.1. Bản chất của phương pháp Dithizon
Dithizon (Diphenyl thiocacbazon) có công thức:
Dithizon: tan trong Cacbon tetraclorua và Cloroform: có màu xanh lá cây.
Trong môi trường nước: Dithizon tồn tại cân bằng: HDz H+
+ Dz-
Do đó, ở trong môi trường trung tính hay acid, Dithizon ở dạng phân tử nhiều
hơn nên chúng ít tan.
Ở môi trường kiềm, độ tan của Dithizon tăng do ở dạng ion nhiều hơn.
Dithizon tạo với các ion kim loại thành các Dithizonnat có màu, ít tan trong nước
nhưng tan nhiều trong Cacbon tetraclorua và Cloroform.
Các Dithizonnat tồn tại dưới hai dạng tùy thuộc vào pH của môi trường:
S C
N
NH NH C6H5
N C6H5](https://image.slidesharecdn.com/giotrnhkimnghimvphntchtp-220420154245/75/Ki-m-nghi-m-va-phan-tich-Th-c-ph-m-Le-Th-Mui-pdf-75-2048.jpg)
More Related Content
Similar to Kiểm nghiệm và phân tích Thực phẩm - Lê Thị Mùi.pdf
Kiểm nghiệm và phân tích Thực phẩm - Lê Thị Mùi.pdf
- 1. ĐẠI HỌC ĐÀNẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM LÊ THỊ MÙI KIỂM NGHIỆM VÀ PHÂN TÍCH THỰC PHẨM Đà Nẵng, tháng 04 năm 2009
- 2. 3 LỜI MỞ ĐẦU Hiệnnay công nghiệp thực phẩm ở nước ta đang phát triển với tốc độ nhanh. Xã hội càng phát triển, nhu cầu của con người đòi hỏi chất lượng thực phẩm ngày càng cao. Để đáp ứng yêu cầu này, ngành công nghiệp thực phẩm cần phải chú trọng đến công tác phân tích chỉ tiêu chất lượng của thực phẩm. Việc kiểm tra chính xác phẩm chất sản phẩm sẽ giúp kiểm nghiệm viên ở cơ sở sản xuất đánh giá đúng đắn kết quả công việc của mình, điều khiển sản xuất theo hướng đã định, phát hiện những thiếu sót về sử dụng nguyên liệu, qui trình, thao tác, tìm ra nguyên nhân không đảm bảo phẩm chất để điều chỉnh kịp thời. Thông qua việc kiểm tra chất lượng của nguyên liệu, bán sản phẩm và sản phẩm để phân cấp chất lượng, trên cơ sở đó, tìm ra biện pháp nâng cao chất lượng sản phẩm và hiệu quả thu hồi sản phẩm nghĩa là nâng cao hiệu quả kinh tế. Bài giảng Kiểm nghiệm và phân tích thực phẩm gồm 3 phần thể hiện trong 6 chương: Phương pháp lấy mẫu, Phân tích cảm quan, Phân tích lý hóa, Phân tích vi sinh, Phân tích độc chất trong thực phẩm và Đánh giá một số mặt hàng thực phẩm Trên cơ sở các kiến thức lý thuyết và thực hành sẽ giúp các kiểm nghiệm viên nắm vững những kiến thức cơ bản để vận dụng đánh giá chất lượng của các mặt hàng thực phẩm. Đà Nẵng, tháng 4 năm 2009
- 3. 4 PHẦN I PHÂN TÍCHCƠ SỞ CHƯƠNG 1 PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU 1.1. Ý nghĩa của việc lấy mẫu - Lấy mẫu là một giai đoạn quan trọng trong việc đánh giá chất lượng lô sản phẩm, công việc đòi hỏi hết sức thận trọng, bởi vì mẫu phải phản ánh chính xác mọi đặc điểm chất lượng và phải đặc trưng cho thành phần trung bình của lô sản phẩm. - Trong thực tế nhiều cuộc tranh cãi về chất lượng hàng hóa, hiệu quả làm việc của thiết bị, hiệu suất, năng suất của một xí nghiệp bao giờ cũng được giải quyết bằng phương pháp lấy mẫu và kết quả phân tích mẫu. Cho nên lấy mẫu nếu không cẩn thận và không đúng phương pháp, thì dù phương pháp phân tích có chính xác cũng dẫn đến việc đánh giá nhầm lẫn thực chất sản phẩm. - Dù kiểm tra những chỉ tiêu nào và bằng phương pháp gì đối với loại sản phẩm nào đều phải thông qua việc lấy mẫu và phải biết cách lấy mẫu. Đối với mỗi loại sản phẩm tùy thuộc vào đặc tính riêng biệt mà có các quy tắc cho việc lấy mẫu khác nhau. Bởi vì khó mà vạch ra được những quy tắc cố định được chấp nhận cho mỗi tình huống và cho mọi sản phẩm. - Lấy mẫu thường nhằm các mục đích sau: + Kiểm tra quá trình sản xuất + Kiểm tra nghiệm thu + Xác định đặc trưng của lô hàng + Để tiến hành các phép thử + Đánh giá thị trường 1.2. Một số khái niệm chung 1.2.1. Mẫu Là một đơn vị hoặc nhóm đơn vị sản phẩm lấy từ một tập hợp (tổng thể để cung cấp thông tin và có thể làm cơ sở đưa ra quyết định đối với tập hợp. 1.2.2. Phép lấy mẫu Là thủ tục lấy mẫu hoặc tạo mẫu 1.2.3. Tập hợp Tập hợp (tổng thể) là toàn bộ các đơn vị sản phẩm được xét. Tùy trường hợp tổng thể có thể là một lô, một số lô hay một quá trình sản xuất. 1.2.4. Đơn vị sản phẩm Đơn vị sản phẩm là một đối tượng cụ thể hoặc một lượng vật chất nhất định để tiến hành các phép thử.
- 4. 5 1.2.5. Đơn vịlấy mẫu Là đơn vị sản phẩm mà từ đó lấy mẫu để phân tích. Đơn vị lấy mẫu có thể là một hay một nhóm đơn vị sản phẩm. 1.2.6. Lô hàng Lô hàng hay lô sản phẩm là lượng hàng nhất định có cùng một tên gọi, cùng một hạng chất lượng, cùng một loại bao gói, cùng một nhãn hiệu, sản xuất trong cùng một xí nghiệp và cùng một khoảng thời gian gần nhau, cùng một giấy chứng nhận chất lượng, vận chuyển cùng một phương tiện và được giao nhận cùng một lúc. 1.2.7. Mẫu ban đầu Là một lượng sản phẩm được lấy cùng một lúc từ một đơn vị tổng thể (có bao gói hoặc không có bao gói). 1.2.8. Mẫu riêng Mẫu riêng (còn gọi là mẫu cơ sở) là mẫu thu được bằng cách phối hợp nhiều mẫu ban đầu lấy từ một tập hợp để làm đại diện cho tập hợp đó. 1.2.9. Mẫu chung Là tập hợp tất cả các mẫu riêng của một tập hợp. 1.2.10. Mẫu trung bình Là mẫu được chuẩn bị từ mẫu chung nhằm để tiến hành các phân tích. 1.2.11. Mẫu phân tích Là mẫu trung bình trộn đều và chia làm nhiều phần như nhau, lấy một ít làm mẫu phân tích. 1.3. Yêu cầu chung của việc lấy mẫu - Mẫu lấy phải đại diện về mặt phẩm chất cho một mặt hàng. - Mẫu phải có phẩm chất ổn định trong suốt thời gian lưu và bảo quản mẫu. - Mẫu phải đúng quy cách, dụng cụ, cách lấy và số lượng lấy từng loại sản phẩm cụ thể theo quy định. 1.4. Phương pháp lấy mẫu 1.4.1. Chỉ dẫn ban đầu 1.4.1.1. Địa điểm lấy mẫu Lấy mẫu tại nơi bảo quản, bốc dỡ hay vận chuyển, tại từng điểm (hoặc sau từng thiết bị) trong quá trình sản xuất, tại điểm nhập nguyên liệu và xuất thành phẩm. 1.4.1.2. Kiểm tra sơ bộ lô sản phẩm Trước khi lấy mẫu phải kiểm tra sơ bộ tính đồng nhất của lô hàng dựa theo các quy định chung và đối chiếu với hồ sơ lô hàng kèm theo và kiểm tra đầy đủ tình trạng bao bì trong lô hàng đó. Nếu lô hàng đang bảo quản trong kho thì cần kiểm tra tình trạng kho. Trong trường hợp sản phẩm không đồng nhất (như hư hỏng từng phần hay ẩm ướt, nhiều quy trình sản xuất khác nhau…) thì phải chia lô hàng ra nhiều phần nhỏ, mỗi phần có tính chất gần như nhau làm một lô hàng riêng biệt. Trước khi lấy mẫu cần xem xét bao gói của sản phẩm và chừng mực có thể cần xem xét bao gói của từng đơn vị sản phẩm. Sản phẩm trong bao gói bị hư hỏng phải
- 5. 6 được loại bỏvà ghi chú trong biên bản lấy mẫu. 1.4.1.3. Vị trí lấy mẫu Vị trí lấy mẫu được xác định theo vị trí ngẫu nhiên nhưng cần làm sạch sản phẩm lấy ra không bị dây bẩn. 1.4.1.4. Trường hợp dây bẩn ngẫu nhiên Nếu như ngẫu nhiên trên bề mặt sản phẩm bị dây bẩn thì phải nhẹ nhàng bỏ đi. Trường hợp khi sự dây bẩn lại ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm hoặc làm thay đổi tính chất của sản phẩm thì không được loại bỏ mà phải xem đó như một thành phần của sản phẩm. 1.4.2. Dụng cụ lấy mẫu 1.4.2.1. Hình dáng Đối với các loại sản phẩm khác nhau, hình dáng của các loại dụng cụ đựng mẫu cũng khác nhau. Cần sử dụng những dụng cụ nào có thể cho ta khả năng lấy được mẫu ban đầu từ những độ dày bất kỳ của các lớp khác nhau của lô hàng. Hình dáng, vật liệu chế tạo và độ lớn, độ dài của dụng cụ lấy mẫu và dụng cụ chứa mẫu đều phải dựa vào các tiêu chuẩn phù hợp cho từng loại sản phẩm riêng biệt. Ngoài ra các chi tiết phụ như que, dây, ống dẫn, nút…cũng phải bảo đảm chất lượng dưới tác dụng hóa lí của sản phẩm. Đối với các sản phẩm dạng lỏng hoặc khí thì thường dùng các dụng cụ như ống dây… từ vật liệu bằng nhựa hay thủy tinh. Dụng cụ lấy mẫu từ túi hàng: xiên bao tải, hình trụ xiên, hình nón, muỗng xúc cầm tay. Dụng cụ lấy mẫu từ đống hàng gồm xẻng, muỗng xúc cầm tay, dụng cụ lấy mẫu hình trụ, hình nón, máy lấy mẫu và các dụng cụ khác. Ngoài ra còn có các dụng cụ chung khác như: - Dụng cụ mở hòm - Khay trộn mẫu (phải khô sạch, không có mùi lạ). - Túi đựng mẫu bằng PE hay lọ thủy tinh nút mài, sạch khô không có mùi lạ - Cân kỹ thuật - Đèn cồn, dao, kéo 1.4.2.2. Chuẩn bị dụng cụ để lấy mẫu Dụng cụ lấy mẫu phải được rửa sạch, sấy hoặc lau khô, ít nhất phải được tráng cồn hoặc vài lần bằng sản phẩm cần lấy mẫu. Sản phẩm đã dùng để tráng dụng cụ cần thiết không được dùng lại để làm mẫu phân tích (không được trộn chung với mẫu). Cần đặc biệt giữ gìn cẩn thận để bảo đảm tất cả các dụng cụ lấy mẫu và các vật chứa mẫu đều sạch, khô không bị nhiễm bẩn ngẫu nhiên như nước, bụi. 1.4.3. Các dạng mẫu thường lấy để kiểm tra Mẫu lấy từ dây chuyền sản xuất gồm mẫu nguyên liệu, bán thành phẩm hoặc thành phẩm. Đây là một hệ thống mẫu liên tục, việc lấy mẫu cho phép kiểm tra quy trình sản xuất có ổn định hay không. Mẫu lấy trong một lô, thường là mẫu lấy trong kho nguyên liệu hoặc kho bán
- 6. 7 thành phẩm. Đólà một tập hợp đã xác định. Mẫu đó cho phép xác định và đánh giá chất lượng của sản phẩm, thông thường là đánh giá theo tỉ lệ khuyết tật. Thông thường tùy theo các loại mặt hàng mà quy định mẫu sao cho phù hợp, dễ đại diện, dễ phân tích: Đối với sản phẩm lỏng đóng chai, đóng hộp như nước khoáng, nước giải khát, sữa… đơn vị mẫu là chai hoặc hộp. Đối với sản phẩm rời như quả trứng, quả cam, kẹo bánh… thì đơn vị mẫu là quả, thùng hay một đơn vị khối lượng, nhưng đối với sản phẩm quả nhỏ như nho thì đơn vị mẫu là chùm hoặc kilogam. Phải tiến hành lấy mẫu nhanh chóng và với điều kiện không để cho tính chất của sản phẩm bị ảnh hưởng ( như mưa, nắng, bụi, nóng, lạnh…). Trong quá trình lấy mẫu ban đầu và trong tất cả các thao tác tiếp theo phải cẩn thận để tránh không gây nhiễm bẩn mẫu hoặc bất kì một sự biến đổi nào khác có thể gây ảnh hưởng bất lợi đến dư lượng hoặc công việc phân tích hay làm cho mẫu thí nghiệm đại diện cho mẫu chung. 1.4.3.1. Lấy mẫu sản phẩm có bao gói Các bao gói được lấy độc lập với dự kiến của người lấy dù chất lượng trong các bao gói đó là tốt hay xấu. Khi lấy mẫu ngẫu nhiên các bao gói để lấy mẫu ban đầu tiến hành vào lúc bốc dỡ hay xếp sản phẩm thì phải sử dụng quy tắc: Lấy mẫu đều đặn nghĩa là việc lấy bao gói hoặc mẫu ban đầu tiến hành trong khoảng thời gian gần bằng nhau (để các mẫu thu được có giá trị gần bằng nhau). Nếu việc bốc dỡ hay vận chuyển xảy ra với nhịp độ không đều (tức là trong một đơn vị thời gian vận chuyển một lượng sản phẩm không bằng nhau) thì số lượng bao gói hoặc số mẫu ban đầu phải lấy với lượng gần bằng nhau trong những khoảng thời gian khác nhau tùy thuộc vào tốc độ vận chuyển. Mẫu ban đầu phải lấy từ các vị trí khác nhau của bao gói ở các độ dày khác nhau của lô. 1.4.3.2. Lấy mẫu sản phẩm lỏng, sệt, bột nhão Trường hợp sản phẩm đang chảy hoặc được khuấy đảo tốt thì cần làm với dụng cụ đựng sản phẩm để lấy mẫu. Khi lấy cần chú ý đến bề sâu của vật chứa và chiều cao của cột chất lỏng. Cần phải lấy mẫu ở tất cả các độ cao của chất lỏng. Mẫu phải được trộn kĩ bởi vì chỉ một lượng nhỏ của mẫu cũng có thể cho thông tin chính xác về tổng thể của nó. Nếu khó trộn thì có thể lấy mẫu theo từng lớp, vùng, cụm. Chú ý không nên lấy chất lỏng ở gần thành ống, tại các chỗ uốn, gấp, chất lỏng tại đây không phản ánh giá trị thực của tổng thể. Chất lỏng có độ nhớt quá lớn thường không đồng đều vì vậy có thể đun nóng hoặc làm đông đặc để sử dụng phương pháp lấy mẫu chất rắn. 1.4.3.3. Lấy mẫu chất khí * Trường hợp lấy mẫu chất khí ở trạng thái động Ống lấy mẫu cần đặt vào giữa dòng không khí. Nếu trong dòng khí có chất rắn
- 7. 8 (bụi , hạt…)thì ống lấy mẫu phải thẳng, miệng rộng để dễ lau chùi và sửa chữa. Khi lấy mẫu cần phải để cho khí trong ống lấy mẫu được thay thế hoàn toàn, bởi vậy ống lấy mẫu cần ngắn và xác định đúng thời gian khi tổng thể thay thế hoàn toàn khí của ống. Khi lấy mẫu khí tại nơi có áp suất âm (thấp hơn môi trường) cần kiểm tra sự rò rỉ của ống, sau khi lấy cần cân bằng áp suất để tránh lọt ra ngoài hoặc ngược lại. * Trường hợp lấy mẫu chất khí ở trạng thái tĩnh Trường hợp này do khí đã được trộn sẵn nên có thể lấy mẫu tại một điểm bất kỳ. Tuy nhiên cũng cần kiểm tra việc trộn và tránh sự không đồng đều do tỷ trọng khác nhau gây nên. * Nếu khí ở trạng thái nửa tĩnh. Chúng ta coi như mẫu đồng đều nhưng cần tránh lấy ở miệng bình, lấy ở nơi được coi là trộn kỹ. * Lấy mẫu sản phẩm dạng rời và không bao gói Với sản phẩm có dạng hạt, nói chung có sự khác nhau về giá trị của chỉ tiêu giữa hạt lớn và hạt nhỏ, vì vậy cần tạo mẫu sao cho sự phân bố giữa các hạt trong mẫu gần giống với sự phân bố giữa các hạt trong lô. Trong sản xuất (trong quá trình làm sạch, chế biến, đóng gói, vận chuyển, bốc dỡ …) hoặc trong thời gian bảo quản các loại hạt có cùng kích thước và tỷ trọng thường tập trung vào một nơi, vì vậy nên lấy mẫu khi sản phẩm ở trạng thái động và nên tăng số lượng mẫu ban đầu và mẫu riêng. 1.4.4. Chuẩn bị mẫu 1.4.4.1. Lấy mẫu sản phẩm có bao gói Tất cả các mẫu ban đầu lấy được cho vào bình đựng sạch và khô có nắp đậy kín. Mẫu chung nhận được bằng cách đó được trộn cẩn thận để thu được một hỗn hợp đồng nhất, sau đó lấy từ hỗn hợp này mẫu trung bình thí nghiệm. 1.4.4.2. Chuẩn bị mẫu sản phẩm dạng hạt và cục Tất cả các mẫu ban đầu lấy được cho vào một dụng cụ (chai, túi ni lông hai lớp) sao cho sản phẩm không bị dây bẩn hoặc bị hút ẩm, bay hơi nước. Trong trường hợp sản phẩm dạng cục trước tiên phải nghiền thành cục nhỏ hơn (với kích thước không quá 25mm). Dụng cụ nghiền phải làm từ vật liệu cứng hơn so với sản phẩm và không được làm bẩn hay thay đổi tính chất của sản phẩm. Nếu trong mẫu có lẫn cục khác biệt với sản phẩm thì hoặc nghiền nhỏ rải đều hoặc bỏ đi và trong tính toán cuối cùng phải tính luôn cả phần tạp chất này. Sau khi nhận được mẫu chung bằng cách trên, cần trộn đều và tiếp tục nghiền cho nhỏ đến kích thước yêu cầu (tùy thuộc từng loại sản phẩm) và lược giản để được mẫu trung bình thí nghiệm. 1.4.5. Bao gói , vận chuyển, bảo quản mẫu trung bình Mẫu trung bình thí nghiệm được đụng trong các dụng cụ sạch, trơ để tránh sự nhiễm bẩn từ bên ngoài tránh làm hư hỏng mẫu trong khi vận chuyển. Dụng cụ chứa mẫu phải được niêm phong sao cho có thể phát hiện được trường
- 8. 9 hợp mở tráiphép và gửi ngay đến phòng thí nghiệm càng sớm càng tốt để tránh mất mát hay hư hỏng. Mẫu lưu phải được bảo quản trong điều kiện khô ráo, sạch sẽ, thoáng mát ở nhiệt độ và độ ẩm của không khí phù hợp với từng loại sản phẩm. Trên mỗi bao gói mẫu sản phẩm phải ghi rõ: • Tên và loại sản phẩm • Số lô hàng • Tên cơ sở sản xuất • Ngày tháng sản xuất • Khối lượng mẫu • Người lấy mẫu, ngày và nơi lấy mẫu Nơi giữ mẫu phải kèm theo biên bản lấy mẫu và phiếu yêu cầu kiểm nghiệm. - Khi gửi mẫu đi phải kèm theo báo cáo ghi rõ tình trạng lô hàng khi lấy mẫu và kỹ thuật lấy mẫu (theo phương pháp nào của TCVN, Tiêu Chuẩn Quốc tế). Nếu lấy mẫu khác với tiêu chuẩn đặt ra thì cần thuyết minh rõ cơ sở của phương pháp được sử dụng. - Mẫu gửi đi kiểm nghiệm phải được niêm phong kỹ, nếu gửi mẫu đi xa hoặc có sự tranh chấp thì phải dán giấy có đóng dấu ở phía ngoài nút dây buộc hay kẹp dấu xi cẩn thận. - Đối với mẫu dễ bị hư hỏng thì phải đưa gấp đến nơi kiểm nghiệm để đảm bảo mẫu không bị biến đổi khi đưa vào kiểm nghiệm. - Ngoài bao bì đựng mẫu phải có nhãn, nội dung của nhà SX như sau: + Tên và số lượng lô hàng + Nơi lấy mẫu + Ngày, giờ lấy mẫu + Nơi cất giữ mẫu kiểm nghiệm 1.4.6. Biên bản lấy mẫu Khi lấy mẫu phải lập biên bản, nội dung của biên bản lấy mẫu như sau: + Họ, tên, chức vụ của người lấy mẫu + Tên và địa chỉ cơ quan lấy mẫu + Họ, tên người hay tên cơ quan có hàng cần phân tích + Nơi lấy mẫu + Ngày, giờ lấy mẫu + Tên hàng và số lượng hàng + Số lượng mẫu + Cách lấy mẫu + Bao gói mẫu + Chữ ký của người có hàng và người lấy mẫu
- 9. 10 CHƯƠNG 2 PHÂN TÍCHCẢM QUAN So với các kỹ thuật phân tích dùng trong lĩnh vực thực phẩm, phân tích cảm quan có đặc trưng là: con người không chỉ là kỹ thuật viên mà còn là “thiết bị phân tích” cung cấp số liệu. Đặc trưng này đã giải thích cho việc ra đời rất sớm của môn “nếm thử” và việc phát triển rất nhanh của phương pháp phân tích cảm quan trong hai thập kỷ vừa qua. Phân tích cảm quan không đòi hỏi đào tạo nhiều: việc thành lập và huần luyện một nhóm đánh giá cảm quan không khó khăn, chi phí ít. Hơn nữa để phân tích và đánh giá chất lượng mùi vị của sản phẩm, phương pháp cảm quan là không thể thay thế. Tuy nhiên mức độ nhạy cảm của người thử thay đổi theo nhiều yếu tố và rất khác nhau giữa những người thử dẫn đễn việc khai thác chúng hạn chế hơn phương pháp dùng thiết bị. Hiện nay ở các nước phát triển, khoa học cảm quan được đánh giá cao trong số các phương pháp kiểm tra chất lượng thực phẩm. Việc ứng dụng tin học trong đánh giá cảm quan là khá phổ biến. Ngoài việc cất giữ và xử lý số liệu theo các chuẩn thống kê, tin học còn tham gia “điều hành” một buổi thử. Đó là những thiết bị chuyên dụng giúp nhân viên phòng cảm quan lựa chọn phương pháp thử, số lượng và phương pháp chuẩn bị mẫu, cách đặt câu hỏi và cho phép các thành viên trả lời để xử lý kết quả. 2.1. Khái niệm 2.1.1. Định nghĩa “Phân tích cảm quan là kỹ thuật sử dụng các cơ quan cảm giác của con người để tìm hiểu, mô tả và định lượng các tính chất cảm quan của một sản phẩm thực phẩm như màu sắc, hình thái, mùi vị và cấu trúc”. Trong phân tích cảm quan, các giác quan của người thử được sử dụng như một dụng cụ đo để tìm hiểu và mô tả để chỉ ra các tính chất cảm quan khác nhau của thực phẩm. Các tính chất này được nhận biết bởi các cơ quan cảm giác và có tính chất khách quan vốn có của sản phẩm, nó không phụ thuộc vào người thử. Khi phân tích các tính chất thị hiếu bị loại bỏ và yêu cầu người thử hãy mô tả sản phẩm theo những tính chất riêng biệt, đặc trưng. Sau đó định lượng tỷ trọng của từng tính chất trong số các tính chất được chỉ ra để khẳng định mức độ quan trọng của các chỉ tiêu cảm quan. “Đánh giá cảm quan” thực phẩm ngoài mục đích phân tích sản phẩm theo các tính chất cảm quan vốn có còn bao hàm cả nội dung thị hiếu đối với các tính chất hoặc với chính sản phẩm đó. Nội dung thị hiếu thường là câu trả lời câu hỏi “thích hay không thích”, “thích nhiều hay thích ít”. Người ta nói đánh giá cảm quan biểu thị “phản ứng” của người tiêu thụ về sản phẩm, cho nên kết quả thường phân tán. Kết quả của một phép thử cảm quan lên sản phẩm đối với một chỉ tiêu nào đó thường được lượng hóa bằng điểm hay bằng lời đều là kết quả “đánh giá” chỉ tiêu đó khi đã “phân tích sản phẩm để hiểu biết bản chất của từng chỉ tiêu.
- 10. 11 2.1.2. Tính kháchquan và chủ quan của phương pháp Phương pháp khách quan là phương pháp mà trong đó hệ quả của ảnh hưởng của con người khi thao tác được tối thiểu hóa. Phương pháp chủ quan là phương pháp mà trong đó hệ quả của ảnh hưởng của con người khi thao tác không được tối thiểu hóa. Để đảm bảo cho phương pháp phân tích cảm quan là một phương pháp khách quan cẩn tuân thủ các điều kiện sau: Các nghiên cứu phải được thực hiện theo quy định cụ thể, từ mở đầu cho đến khi viết báo cáo. Những người tham gia công tác cảm quan cần được huấn luyện khi đó loại bỏ được những thủ thuật các nhân. Chon lựa chính xác các phép thử sẽ làm giảm hiệu ứng của những ảnh hưởng bên ngoài, chúng ta sẽ thu được những kết quả khách quan. Những kết quả này nếu được xử lí một cách đúng đắn, chúng ta sẽ có những kết quả chính xác. “Phương pháp cảm quan là phương pháp dùng các giác quan của con người để đánh giá chất lượng của sản phẩm thực phẩm thông qua các chỉ tiêu cảm quan của thực phẩm đó”. 2.2. Giác quan và cảm giác nhận được 2.2.1. Thông tin cảm giác Việc nhận được những tính chất cảm quan của thực phẩm là nhờ tác động của các giác quan. Nguyên lý chung của việc tiếp nhận, truyền và xử lý thông tin của hệ thống giác quan là tương tự nhau. Trước hết phải có cơ chế kích thích như các chất hóa học trong mùi, vị; ánh sáng trong kích thích thị giác, âm thanh trong kích thích thính giác, nhiệt độ hay trạng thái trong kích thích xúc giác. Cơ quan thụ cảm của giác quan là những trung tâm bề mặt. Trên trung tâm bề mặt, hệ thống truyền tin được xây dựng và tập trung từ hàng nghìn đến hàng triệu chuỗi khuếch đại song song tạo nên một điện thế được khuếch đại lớn để truyền thông tin và truyền dưới dạng điện. Quá trình vận chuyển thông tin xảy ra khá phức tạp qua những khớp thần kinh để tới bán cầu đại não. Cường độ của chất kích thích được xác định bởi tần số của dòng điện có bản chất kích thích (vị chua, mặn, khét…) được xác định bởi một cơ chế khá phức tạp. 2.2.2. Vị Vị là một cảm giác hóa học gây ra bởi các phân tử hay ion trong dung dịch khi tiếp xúc với các cơ quan thụ cảm vị. Ở người các cơ quan thụ cảm này nằm trên mặt lưỡi, trong vòm miệng và yết hầu. Người ta ghi nhận có 4 vị cơ bản với 4 chất gây vị đặc trưng là: Ngọt – đường saccaroza Mặn – muối ăn Chua – axit citric Đắng – cafein
- 11. 12 Vị được tiếpnhận chủ yếu và nhạy bén nhất trên bề mặt lưỡi. Bằng mắt thường chúng ta cũng cảm nhận thấy bề mặt lưỡi được bao phủ bởi các nhú có hình dạng và kích thước khác nhau. Đó là các gai vị giác. Có 4 loại gai vị giác phân bố trên bề mặt lưỡi tương ứng với các vùng cảm nhận cực đại của 4 vị cơ bản. Vị đóng vai trò rất quan trọng trong đánh giá cảm quan thực phẩm. Các sản phẩm rắn hay lỏng khi nhai hay uống đều cho cảm giác vị. Khi đánh giá vị, nếu sản phẩm rắn thì phải nhai nhỏ, cho nước bọt hòa tan và trải đều trên bề mặt lưỡi để cho khả năng nhận vị cao nhất. Đối với sản phẩm lỏng, có thể rít khí qua kẽ răng để chất lỏng tráng đều trên bề mặt lưỡi và có thể tới yết hầu. Đối với sản phẩm có vị đắng chát như chè, café, kẹo socôla, rượu vang, việc đưa sản phẩm về cuối lưỡi và nuốt một ít sản phẩm là quan trọng vì các vị này được nhận biết mạnh ở cuối lưỡi. 2.2.3. Mùi Mùi là cảm giác hóa học gây ra bởi sự tác động của các phân tử chất bay hơi sau khi vào mũi hòa tan trong chất lỏng của niêm dịch mũi với những cơ quan thụ cảm nằm trên lông mao của màng nhầy khứu giác. Mũi có thể nhận biết mùi của những chất bay hơi có nồng độ rất thấp khoảng từ 107 – 1017 phân tử trong 10 ml không khí. Khả năng nhận biết và cường độ mùi nhận được phụ thuộc trực tiếp vào nồng độ chất bay hơi chứa trên bề mặt chất mang. Khi so sánh cường độ mùi của các mẫu, sản phẩm phải được chứa trong dụng cụ có cùng hình dạng, kích thước. Thể tích không khí trên bề mặt thoáng phải như nhau. Khi ngửi, mũi phải để cách sản phẩm một khoảng cách như nhau đối với tất cả các mẫu. 2.2.4. Màu sắc và hình dáng Cảm giác màu nhận được là do tác động của chùm tia sáng lên mắt. Mắt người nhận rõ chùm tia sáng có màu sác từ tím chuyển sang lam., lục, vàng, da cam, rồi đến màu đỏ trong bước sóng khoảng 380 – 740 nm. (Vùng bước sóng nhỏ hơn 380 nm là vùng tia cực tím, vùng lớn hơn 740 nm là vùng hồng ngoại). Các chất màu trong thực phẩm có nguồn gốc tự nhiên như màu xanh của clorophin hoặc sinh ra trong gia công chế biến bởi phản ứng caramen, malanoidine…Ngoài ra các chất màu cũng có thể được bổ sung trong công đoạn hoàn thành sản phẩm như các loại nước giải khát… 2.2.5. Hình trạng Hình trạng và cấu trúc của vật chất nhận biết được là do các kích thích về cơ học và nhiệt lên các cơ quan xúc giác. Những kích thích cơ học khi tiếp xúc với sản phẩm đã làm thay đổi hình dạng phần cơ và cho ta cảm giác về hình dạng, cấu trúc của vật. Kích thích nhiệt cho ta biết sự khác nhau về nhiệt độ của vật đối với da. Người ta coi da và niêm mạc nhìn thấy là cơ quan xúc giác. Trong đó bàn tay với các đầu ngón tay rất nhạy cảm với nhiệt, với hình dáng cấu trúc của vật rắn và nhớt. Trong miệng bề mặt lưỡi và phần cơ xung quanh vòm miệng nhạy cảm với hình dạng cấu trúc và tính chất bề mặt của sản phẩm: răng có tác dụng xác định cấu trúc vật khi nhai. Để xác định độ cứng hay mềm của sản phẩm có thể xác định bằng cách bấm, bẻ, bóp bằng đầu ngón tay, hoặc cắn, nhai bằng miệng. Độ mịn, độ nhớt có thể xác
- 12. 13 định bằng đầungón tay hay miệng như đối với các sản phẩm bột nhuyễn hay các loại xirô. 2.2.6. Âm thanh Âm thanh nhận biết được là kết quả của một nguồn sóng âm truyền trong môi trường đàn hồi thống nhất và tác động lên màng nhĩ tai. Tai người nhận biết âm thanh có tần số trong khoảng 20Hz – 20000Hz. (Vùng sóng nhỏ hơn 20Hz gọi là vùng hạ âm và cao hơn 20000Hz gọi là siêu âm). Sóng âm sau khi truyền qua tai ngoài, đến tai giữa, tác động lên màng nhĩ, được truyền qua xương búa, xương đe để tác động lên tai trong (còn gọi là ốc tai), là một ống cuộn hình con ốc là phần cơ bản nhận và truyền âm thanh lên não. Thính giác dùng nhận biết độ dòn của vật khi bị cắn vỡ, bị bẻ gãy có phát ra âm thanh. Âm thanh này nếu phát ra từ trong miệng khi nhai (miệng khép kín sẽ được truyền từ miệng lên ốc tai và cho ta âm thanh khác với âm thanh khi nhai mà miệng không khép kín. Hầu hết các âm thanh nhận được đều là hỗn hợp của các âm thanh có tần số khác nhau gọi là hợp âm. Ví dụ: kẹo, bánh đa, vỏ bánh mì…Đôi khi thông qua độ dòn, người ta xác định được độ ẩm của sản phẩm như chè, hạt café sau sấy, có thể bóp bằng tay hay cắn vỡ hạt. 2.2.7. Ngưỡng cảm giác 2.2.7.1. Định nghĩa Khi thử nếm, mỗi một mức kích thích cho ta một cảm giác khác nhau. Thí dụ khi nếm chè ướp hương nhài ở nồng độ hương rất thấp, chúng ta chỉ có thể biết là có ướp hương nhưng chưa dám khẳng định là hương nhài hay hương sen. Khi nồng độ hương cao hơn, chúng ta nhận được cường độ hương càng lớn nhưng phải cần một cường độ đủ lớn để có thể phân biệt được nó với cường độ thơm trước đó. Mỗi một mức cảm giác nhận được đó gọi là ngưỡng cảm giác. Ngưỡng cảm giác là giá trị của một kích thích cảm giác cần thiết để đạt được cảm giác đặc trưng nào đó. Đối với mùi vị, các giá trị ngưỡng được đo bằng nồng độ các chất kích thích trên một chất mang nào đó. 2.2.7.2. Các loại ngưỡng cảm giác Ngưỡng cảm phát hiện: là giá trị của một kích thích cảm giác có thể gây một cảm giác. Ngưỡng cảm xác định: là giá trị của kích thích cảm giác nhỏ nhất cho phép xác định bản chất của kích thích đó. Ngưỡng cảm cuối cùng: là giá trị tối đa của kích thích mà vượt qua đó cường độ cảm giác không tăng nữa. Ngưỡng( phân biệt) sai biệt: Là sự khác nhau nhỏ nhất về cường độ vật lí của một kích thích để có thể nhận biệt được sự khác nhau đó. Giá trị ngưỡng cảm này khác nhau ở những nồng độ khác nhau.
- 13. 14 Việc huấn luyệncó thể cho phép giảm ngưỡng cảm và giảm độ phân tán giữa các thành viên. Người có ngưỡng cảm thấp, câu trả lời sẽ mang lại nhiều thông tin hơn và sẽ có ý nghĩa hơn. Ngưỡng cảm giác có vai trò quan trọng trong đánh giá cảm quan. Thông qua nó để ghi nhận các kết quả trả lời của hệ thống giác quan và đánh giá độ tin cậy của những câu trả lời đó. 2.3. Phép thử cảm quan 2.3.1. Quan hệ giữa kích thích và cảm giác Các phép thử đều dựa trên một cơ sở chung: khi có độ kích thích đủ lớn, cơ quan cảm giác sẽ tiếp nhận, xử lí về bản chất và cường độ của kích thích đó. Khi cường độ kích thích tăng thì cường độ cảm giác nhận được cũng tăng theo. Mối quan hệ được biểu diễn theo hàm số mũ: S = k.In Hoặc lnS = nlnI + K Trong đó: S: cường độ cảm giác I: cường độ kích thích K và k: hằng số n: hệ phụ thuộc phép thử, bản chất kích thích và thao tác thực hành 2.3.2. Phân loại và lựa chọn phép thử Trong thực hành đánh giá cảm quan, người ta chia 2 nhóm phép thử: nhóm phép thử phân biệt và nhóm phép thử thị hiếu (tiếp thị). 2.3.2.1. Nhóm phép thử phân biệt Thường dùng trong phân tích cảm quan để so sánh hoặc mô tả sự khác nhau về một hay nhiều tính chất của sản phẩm. Khi sự khác nhau rất nhỏ, người ta thường dùng các phép thử sai biệt để xem xét sự khác nhau đó có phát hiện được không: phép thử tam giác, phép thử 2 – 3. Khi sự khác nhau là rõ ràng, thường dùng phép thử mô tả để biểu diễn mức độ sai khác của các sản phẩm: phép thử so hàng, cặp đôi, mô tả, ước lượng, cho điểm… 2.3.2.2. Phép thử thị hiếu Dùng lấy ý kiến của người tiêu thụ về sự ưa thích và mức độ ưa thích đối với sản phẩm. Người ta thường dùng các phép thử cặp đôi thị hiếu, so hàng thị hiếu hay mô tả theo thang cường độ thị hiếu. Ngoài ra nhóm các phép thử “đánh giá chất lượng” và “phép thử tiếp thị” bao hàm cả hai nội dung phân biệt và thị hiếu. Đứng trước một vấn đề của sản xuất hay kiểm tra chất lượng được đặt ra, việc đầu tiên là chọn chính xác phép thử. Nói chung không nên đặt ra quá nhiều yêu cầu (nhiều câu hỏi khác nhau cho các thành viên) vì sẽ làm cho kết quả phân tán và khó xử lí. Cách tiến hành từng phép thử sẽ được mô tả cụ thể phần sau. 2.3.3. Một số phép thử khi biết tính chất cần so sánh 2.3.3.1. Phép thử so sánh cặp đôi
- 14. 15 Trong phép thửso sánh cặp đôi, các mẫu được chuẩn bị theo từng cặp và được kí hiệu bằng mã số. Trong mỗi cặp có một mẫu chuẩn và một mẫu cần thử. Hãy xác định trong hai mẫu đó, mẫu nào có cường độ lớn hơn hoặc bé hơn đối với một chỉ tiêu nào đó (ngọt, chua, thơm…). Nếu so sánh nhiều hơn hai mẫu với nhau, hãy sắp xếp các giá trị có cường độ tăng hay giảm dần theo thứ tự. Câu hỏi thường đặt ra là mẫu nào hơn mẫu nào?. Trong thử thị hiếu của người tiêu thụ câu hỏi có thể là: bạn thích mẫu nào hơn?. Nếu muốn thì đặt thêm câu hỏi về mức độ ưa thích từ ít đến nhiều theo thang điểm từ 1 đến 5 hoặc từ 1 đến 9. Nếu người thử không nhận thấy mẫu nào hơn thì phải chọn một mẫu bất kì trong hai mẫu. Vì vậy xác suất câu trả lời đúng ngẫu nhiên là ½. Ứng dụng: Phương pháp này dùng để so sánh qui trình sản xuất mới và cũ. Chứng minh hay không chứng minh thực sự tăng hay giảm nồng độ chất của một chỉ tiêu nào đó trong những trường hợp ta nhận thức được. 2.3.3.2. Phép thử cho điểm Trong thực tế nhiều khi người ta muốn so sánh nhiều mẫu với nhau về nhiều tính chất cảm quan, ở nhiều mức độ khác nhau. ta có thể sử dụng phương pháp cho điểm theo các điểm khác nhau. Mỗi giá điểm ứng với một chất kích thích nhất định thu nhận được. 2.3.3.3. Phép thử sắp xếp thứ tự (so hàng) Cho phép đánh giá một loạt mẫu thử, thành viên cần sắp xếp theo cường độ hay mức độ tăng hay giảm dần đối với một chỉ tiêu nào đó. Để tiến hành so sánh hàng theo cách thức vị trí hàng của các mẫu, cần chú ý: - Thứ tự thử: từ trái qua phải - Không lắc mạnh hay khuấy trộn (mất CO2) - Hình thức trình bày các mẫu phải đồng nhất, chú ý quá trình ngẫu nhiên hóa thứ tự mẫu thử. Ứng dụng: Phép thử này có thể dùng trong các nhóm phép thử phân biệt hay nhóm các phép thử thị hiếu. So sánh các sản phẩm trong quá trình thực nghiệm hoặc trong quá trình cải tiến các sản phẩm dựa trên các ưu thế theo các giá trị cường độ, mức độ ưa thích của một sản phẩm nào đó. 2.3.3.4. Phép thử mô tả mùi, vị (profil) Phép thử gồm hai hay nhiều mẫu thử được kí hiệu bằng mã số. Dùng chữ hoặc số với thang thích ứng để mô tả mùi vị của các sản phẩm thực phẩm. Người thử được mời xác định xem các mẫu này khác nhau ở những đặc tính nào và độ lớn của sự khác nhau này bao nhiêu? Phép thử này yêu cầu phải qua 3 bước: - Chọn các đặc tính cần đánh giá - Thực hiện các phép thử sơ bộ để các thành viên cùng thống nhất cách sử dụng thang cường độ đã đưa ra. - Đánh giá cường độ của các đặc tính đã lựa chọn
- 15. 16 Các kết quảđược biểu diễn dưới dạng đồ thị hay hoa gió. Trong kiểu hoa gió, các tính chất tốt được biểu diễn ở phần nằm trên trục ngang, còn tính chất xấu ở dưới. Khi chỉ có một sản phẩm, người ta thường biểu diễn kiểu hình bán khuyên, còn khi có nhiều sản phẩm biểu diễn kiểu biểu đồ. Ví dụ vẽ biểu diễn đồ thị: Dưới đây là biểu diễn kết quả đánh giá hai loại bánh bích qui A và B dưới dạng đồ thị. Điểm trung bình cho từng mẫu đối với từng chỉ tiêu được dùng để vẽ. Ta đánh dấu điểm trung bình của từng mẫu đối với từng chỉ tiêu vào thang cường độ. Sau đó nối các điểm của sản phẩm A lại với nhau và tương tự như vậy nối các điểm của sản phẩm B. Ta có thể biểu diễn kết quả đánh giá của nhiều mẫu (không nhất thiết phải 2 mẫu). Sản phẩm: bánh qui * Ngoại hình và trạng thái: - Màu sắc - Độ giòn - Hình dạng * Ngửi sản phẩm - Mùi thơm đặc trưng - Mùi bơ - Mùi cháy khét - Mùi bột * Nếm sản phẩm - Vị ngọt - Vị mặn - Độ dễ tan - Độ dính răng Ví dụ biểu diễn hình hoa gió Dưới đây là biểu diễn kết quả đánh giá hai loại bánh bích qui A và B dưới dạng hoa gió. Các tính chất đặc trưng của sản phẩm được biểu diễn trên trục nằm ngang (màu sắc, độ giòn…) còn tính chất không đặc trưng được biểu diễn ở dưới (độ dính răng, mùi bột…). Điểm trung bình cho từng mẫu đối với từng chỉ tiêu được dùng để vẽ. Ta đánh dấu điểm trung bình của từng mẫu đối với từng chỉ tiêu vào thang cường độ (từ 1 đến 9). Sau đó nối các điểm của sản phẩm A lại với nhau và tương tự như vậy nối các điểm của sản phẩm B. Ta có thể biểu diễn kết quả đánh giá của nhiều mẫu (không nhất thiết phải 2 mẫu). Hình 2.1.Kết quả đánh giá hailoại bánh bích quy A và B bằng đồ thị
- 16. 17 Sản phẩm: Bánhqui Nhìn vào kết quả biễu diễn profil, chúng ta có thể nhận ra 2 đặc tính của sản phẩm: - Tính chất nào là tính chất nổi bật trong số các tính chất nghiên cứu. Đó là những tính chất có giá trị cường độ cảm quan lớn. - Trong số các tính chất nghiên cứu (nhất là những tính chất đặc trưng), tính chất nào khác nhau giữa hai sản phẩm. Trong phương pháp này, các kiểm nghiệm viên phải được huấn luyện kĩ, có trình độ cao, phải nắm vững các kiến thức về mùi vị để mô tả, vì trong phương pháp này không áp dụng phương pháp thống kê. Ứng dụng: - Được sử dụng trong trường hợp người ta đã biết chắc chắn các mẫu có sự khác nhau nhưng chưa biết được đặc trưng của sự khác nhau đó là gì? - So sánh các sản phẩm trong quá trình thực hiện, trong quá trình phát triển các sản phẩm cũng như đánh giá trình độ công nghệ, mức chất lượng đã đạt được. 2.3.3.5. Phép thử ước lượng độ lớn Cường độ cảm giác S nhận được quan hệ với cường độ chất kích thích theo hàm: lnS = n.lnI + K Mùi thơm Độ giòn Hình 2.2. Kết quả đánh giá hai loại bánh bích qui A và B dưới dạng hoa gió
- 17. 18 Trong thực tếsản xuất, người ta thường đặt vấn đề: - Với cường độ cảm giác xác định nhận được khi thử nếm thì mẫu có nồng độ (hay cường độ chất kích thích) là bao nhiêu? - Nếu bổ sung một lượng xác định chất kích thích vào sản phẩm thì cường độ cảm giác nhận được là bao nhiêu?. 2.3.4. Một số phép thử khi biết tính chất cần so sánh Các phép thử này dùng để xác định sự khác nhau giữa các mẫu khi người ta không biết bản chất sự khác nhau. Khi thử các thành viên phải tự tìm ra bản chất sự khác nhau giữa các sản phẩm. 2.3.4.1. Phép thử tam giác Có 3 mẫu thử kí hiệu bằng mã số, được biết rằng trong 3 mẫu này có 2 mẫu giống nhau. Người thử được mời xác định xem mẫu nào là mẫu không lặp lại. Nếu người thử không xác định được mẫu không lặp lại thì họ vẫn phải trả lời một mẫu bất kỳ. Do đó, bắt buộc phải có sự “chọn lựa gượng” nếu như người thử không thể phân biệt sự khác nhau giữa các mẫu, xác suất chọn đúng cho câu hỏi này là 1/3. Ứng dụng: + Đánh giá các thành viên trong hội đồng + Trả lời cho nhà sản xuất biết có sự khác biệt hay không để các nhà sản xuất có thể tăng hay giảm nồng độ chất đó. 2.3.4.2. Phép thử 2-3 Có 3 mẫu, trong đó có 2 mẫu giống nhau. Một trong 2 mẫu giống nhau này là mẫu chuẩn kiểm chứng. Người thử được mời xác định xem trong số 2 mẫu còn lại, mẫu nào giống mẫu kiểm chứng. Trong phép thử này, xác suất câu trả lời đúng ngẫu nhiên là 1/2. Ứng dụng: Phép thử 2 -3 hay được dùng hơn phép thử tam giác trong trường hợp sản phẩm có dư vị mạnh, vì nó đòi hỏi ít lần nếm mẫu hơn, do đó các kiểm nghiệm viên đánh giá dễ dàng hơn. 2.3.5. Phép thử cho điểm sản phẩm Phương pháp này được sử dụng để đánh giá tổng quát mức chất lượng của một sản phẩm so với tiêu chuẩn hoặc so với một sản phẩm cùng loại trên tất cả các chỉ tiêu cảm quan: màu sắc, mùi vị, trạng thái…Tình trạng chất lượng của mỗi chỉ tiêu được đánh giá bằng điểm. Giá trị điểm tăng theo mức tăng chất lượng. Tùy theo sản phẩm và quốc gia mà thang điểm sử dụng rất khác nhau (thang 10, 20, 50, 100 điểm). Ở Việt Nam, dùng phương pháp này để đánh giá chất lượng của sản phẩm thực phẩm: phân cấp chất lượng của sản phẩm thực phẩm, cho phép hay không cho phép sản xuất sản phẩm. Trong phương pháp này, các kiểm nghiệm viên dựa vào sự đánh giá để cho điểm theo một thang điểm quy định. Ở nước ta, phương pháp này được quy định trong tiêu chuẩn Việt Nam: TCVN 3215 – 79. Phương pháp này sử dụng hệ 20 điểm xây dựng trên một thang điểm thống nhất có 6 bậc (từ 0 – 5) và điểm từ 1 – 5 ứng với mức khuyết tật giảm dần, điểm 0 ứng với
- 18. 19 chất lượng sảnphẩm “bị hỏng”. Ở điểm 5, sản phẩm coi như không có sai lỗi trong tính chất đang xét (bảng 2.1). Bảng 2.1. Sáu bậc đánh giá chất lượng sản phẩm Bậc đánh giá Điểm chưa có trọng lượng CƠ SỞ ĐÁNH GIÁ 1 5 Trong chỉ tiêu đang xét, sản phẩm có tính chất tốt đặc trưng và rõ rệt cho chỉ tiêu đó, sản phẩm không có sai lỗi và khuyết tật nào 2 4 Sản phẩm có khuyết tật nhỏ hoặc sai lỗi nhỏ hoặc có cả hai nhưng không làm giảm giá trị cảm quan của sản phẩm đó 3 3 Sản phẩm có khuyết tật hoặc sai lỗi hoặc có cả hai. Số lượng và mức độ khuyết tật hoặc sai lỗi làm giảm giá trị cảm quan của sản phẩm đó, nhưng sản phẩm vẫn đạt theo tiêu chuẩn 4 2 Sản phẩm có khuyết tật hoặc sai lỗi hoặc có cả hai. Số lượng và mức độ khuyết tật hoặc sai lỗi làm cho sản phẩm không đạt mức chất lượng qui định trong tiêu chuẩn, nhưng còn khả năng bán được. 5 1 Sản phẩm có khuyết tật hoặc sai lỗi ở mực độ trầm trọng, không đạt mục đích sử dụng chính của sản phẩm đó. Song sản phẩm vẫn chưa gọi là hỏng. Sản phẩm đó không thể bán được, nhưng sau khi tái chế thích hợp, vẫn có thể sử dụng được. 6 0 Sản phẩm có khuyết tật hoặc sai lỗi ở mức độ rất trầm trọng, sản phẩm bị coi là “hỏng”, không sử dụng được. Qui trình đánh giá phải được thực hiện trong phòng phân tích cảm quan đạt yêu cầu. Việc chuẩn bị mẫu phải phù hợp với từng loại sản phẩm theo qui định chặt chẽ. Hội đồng chỉ gồm từ 5 đến 12 chuyên gia có hiểu biết về sản phẩm được đánh giá. Hội đồng có chủ tịch và thư ký để lãnh đạo hội đồng trong quá trình làm việc. Mỗi sản phẩm sẽ có một bảng điểm qui định theo TCVN 3215 – 79. Khi đánh giá, mỗi cảm quan viên làm việc độc lập, căn cứ kết quả ghi nhận được, đối chiếu với bảng mô tả các chỉ tiêu và dùng các số nguyên để cho điểm từ 0 đến 5, ghi vào phiếu và nộp cho thư kí sau giờ làm việc. Thư kí hội đồng sẽ tổng kết điểm của các thành viên và từ đó tính ra điểm chất lượng của sản phẩm. Điểm chưa có trọng lượng: Là điểm từ 0 đến 5 mà các cảm quan viên cho điểm từng chỉ tiêu của một sản phẩm. Điểm trung bình chưa có trọng lượng: Là trung bình cộng các điểm chưa có hệ số quan trọng đối với từng chỉ tiêu của các kiểm nghiệm viên, lấy chính xác đến hai chữ số thập phân sau dấu phẩy.
- 19. 20 Hệ số quantrọng: Trong một sản phẩm, các chỉ tiêu cảm quan có mức độ quan trọng khác nhau nên cần có một hệ số quan trọng để biểu thị mức độ quan trọng của chỉ tiêu đó. Do vậy, giá trị điểm đối với mỗi chỉ tiêu được nhân với một giá trị tương ứng đó gọi là hệ số quan trọng. Khi đánh giá chứng nhận chất lượng đối với sản phẩm mới hoặc sản phẩm cải tiến, hệ số quan trọng được cơ quan có thẩm quyền về kiểm tra chất lượng tạm thời qui định sau khi đã tham khảo ý kiến của các cơ quan có liên quan. Các chỉ tiêu có vai trò lớn thì có hệ số quan trọng lớn hơn. Các hệ số quan trọng mà đối với chỉ tiêu được cho biết trước và tổng các hệ số quan trọng của tất cả các chỉ tiêu đánh giá cho một sản phẩm là 4. Điểm trung bình có trọng lượng: Là tích của điểm trung bình chưa có trọng lượng của một chỉ tiêu với hệ số quan trọng của chỉ tiêu đó. Điểm chung: Là tổng điểm trung bình có trọng lượng của tất cả các chỉ tiêu cảm quan. Điểm chung gọi là điểm chất lượng vì nó quyết định mức chất lượng của một sản phẩm. Để phân cấp chất lượng, TCVN 3215 – 79 qui định các cấp chất lượng đối với các sản phẩm thực phẩm có điểm chung và điểm trung bình chưa có trong lượng đối với một số chỉ tiêu tương ứng trong bảng 2.2. Bảng 2.2. Bảng phân cấp chất lượng sản phẩm. Cấp chất lượng Điểm chung Yêu cầu về điểm TB chưa có trọng lượng đối với các chỉ tiêu Loại tốt 18,6 ÷ 20,0 Các chỉ tiêu quan trọng nhất ≥ 4,7 Loại khá 15.2 ÷ 18,6 Các chỉ tiêu quan trọng nhất ≥ 3,8 Loại trung bình 11,2 ÷ 15,1 Mỗi chỉ tiêu ≥ 2,8 Loại kém (không đạt mức chất lượng qui định trong tiêu7 chuẩn nhưng còn khả năng bán được) 7,2 ÷ 11,1 Mỗi chỉ tiêu ≥ 1,8 Loại rất kém (không có khả năng bán được nhưng sau khi tái chế thích hợp còn sử dụng được) 4 ÷ 7,1 Mỗi chỉ tiêu ≥ 1,0 Loại hỏng (không còn sử dụng được) 0 ÷ 3,9 * Chú ý: Để đạt yêu cầu về chất lượng thì loại sản phẩm đó phải đạt cấp chất lượng loại trung bình trở lên, nghĩa là số điểm trung bình chưa có trọng lượng của mỗi chỉ tiêu cảm quan phải đạt ít nhất là 2,8 điểm và điểm số chung ít nhất phải là 11,2 đối với một sản phẩm. Nếu một chỉ tiêu nào đó có điểm 0 thì nên tiến hành đánh giá lại chỉ tiêu đó. Khi hội đồng đã quyết định cho một chỉ tiêu nào đó điểm 0 thì sản phẩm đó bị đánh giá với số điểm bằng 0. Sản phẩm bị đánh giá là: loại hỏng.
- 20. 21 Đối với mẫusản phẩm đồng nhất, nhận xét của một thành viên trong hội đồng bị bác bỏ khi nhận xét đó chênh lệch quá 1,5 điểm so với điểm trung bình chưa có trọng lượng. Ví dụ: Có 7 kiểm nghiệm viên (kí hiệu A, B, C, D, E, F, G) đánh giá sản phẩm bia với kết quả trình bày ở bảng 2.3 Bảng 2.3. Điểm đánh giá sản phẩm bia của 7 kiểm nghiệm viên. Điểm của các KNV Tên chỉ tiêu A B C D E F G Tổng số điểm Điểm TB chưa có TL Hệ số quan trọng Điểm TB có TL - Màu sắc, độ trong - Độ tạo bọt - Mùi - Vị 3 4 3 3 4 4 3 3 3 3 4 3 3 3 3 4 4 3 4 3 3 2 4 3 3 3 3 4 23 22 24 23 3,29 3,14 3,43 3,29 0,4 0,8 0,8 2 1,32 2,51 2,74 6,58 Điểm chung 13,15 Loại bia trên có điểm chung 13,15 và điểm trung bình chưa có trong lượng của các chỉ tiêu lớn hơn 2,8 nên theo TCVN 3215 – 79 thì bia trên đạt cấp chất lượng loại “trung bình”. 2.4. Một số yêu cầu đánh giá cảm quan 2.4.1. Phòng đánh giá cảm quan (hình 2.3.) Phòng đánh giá cảm quan phải thoáng, sạch, không bị ồn. Các thành viên phải được yên tĩnh và độc lập nên phải làm vách ngăn tạo nên các phòng ốc giữa các thành viên. Hình 2.3.
- 21. 22 2.4.2. Yêu cầuvề dụng cụ cảm quan Nhằm đạt mục đích chung là các mẫu khi cung cấp cho cảm quan viên phải đồng nhất và không gây ấn tượng gì về cơ sở sản xuất hoặc một thành kiến nào khác, các mẫu phải được chuẩn bị cẩn thận và chứa trong các dụng cụ đúng qui định và giống nhau. Tất cả các dụng cụ và đồ dùng phục vụ trong buổi đánh giá phải rửa, giặt sạch trước và sau khi đánh giá. Không được dùng xà phòng thơm để giặt, rửa, không được lau mà phải sấy khô hoặc để khô dụng cụ trên các giá bằng nhựa hay tốt nhất bằng thủy tinh, sứ, thép không gỉ. Trước lúc sử dụng phải kiểm tra lại cẩn thận, đảm bảo các dụng cụ và đồ dùng không có mùi vị gì khác lạ. Tùy từng sản phẩm, các dụng cụ được qui định một cách cụ thể. Nguyên tắc chung: - Dụng cụ phải bằng thủy tinh không màu hay màu trắng (hình 2.5). Có thể bằng vật liệu khác không màu hay màu trắng nhưng phải dễ làm sạch, không giữ mùi vị và không ảnh hưởng đến màu sắc, trạng thái mùi vị của sản phẩm. - Dụng cụ cung cấp cho những cảm quan viên trong hội đồng phải giống nhau về hình dạng, kích thước và vật liệu. Điều này rất quan trọng, nếu không sẽ ảnh hưởng đến kết quả đánh giá. Ví dụ: cùng một loại rượu nho sẽ có màu khác nhau nếu chứa trong 2 cốc có kích thước khác nhau. Nếu không có qui định gì đặc biệt, thông thường các dụng cụ sau đây được dùng để thực hiện đánh giá. Dụng cụ để chuẩn bị mẫu: - Dao, dụng cụ để mở chai, hộp. - Bình thủy tinh to để đấu trộn (chất lỏng). Hình 2.4.
- 22. 23 Hình 2.5. Các loạidụng cụ đánh giá cảm quan
- 23. 24 - Thố, tôto để trộn (đồ hộp, kẹo). - Muỗng, nĩa, kẹp trắng thép không gỉ. Dụng cụ để cảm quan: - Cốc để cảm quan chất lỏng làm bằng thủy tinh tốt, không màu, có nắp đậy. - Chai thủy tinh tốt không màu, có nút nhám để đánh giá màu sắc, độ trong. - Cốc đánh giá bia. - Cốc đánh giá rượu. - Cốc đánh giá trà. - Bình pha trà. - Đĩa cá nhân bằng sứ, sắt tráng men hay thủy tinh trắng. 2.4.3. Nhân viên phòng đánh giá cảm quan Nhân viên phòng đánh giá cảm quan là những người chịu trách nhiệm về chất lượng cảm quan của sản phẩm trước khi đưa ra thị trường. Nhân viên phòng đánh giá cảm quan phải có kiến thức tâm lí học, sinh lí người, toán thống kê, công nghệ thực phẩm, nấu ăn và tin học. 2.4.4. Người thử cảm quan Là những người không có bệnh tật về các giác quan, đều có thể tham gia đánh giá cảm quan thực phẩm. Giới tính, lứa tuổi và tính nghiện hút đều có ảnh hưởng phần nào đến kết quả cảm quan. Những người có ngưỡng cảm thấp sẽ cho các kết quả tin cậy hơn. Trước khi tham gia với tư cách là thành viên của hội đồng đánh giá cảm quan, cảm quan viên phải thực hiện những điều đã được cơ quan tổ chức hội đồng qui định. Cảm quan viên phải có khả năng đánh giá khách quan, có khả năng phân biệt cảm giác, có kiến thức chuyên môn tốt và kiến thức phân tích cảm quan. Tất cả các cảm quan viên phải được kiểm tra trình độ định kì, 6 tháng hoặc 1 năm 1 lần. Trước khi đánh giá 30 phút: - Không được ăn uống và hút thuốc - Không dùng son phấn, nước hoa, xà phòng thơm - Nếu bị mệt, cảm cúm, nhức đầu thì không tham gia buổi thử hôm đó Trong thời gian đánh giá cảm quan: - Không nói chuyện, gây ồn trong phòng - Sử dụng triệt để thời gian làm việc, không ra khỏi phòng sớm - Không tự tiện vào phòng chuẩn bị mẫu 2.4.5. Nhóm thử cảm quan “Nhóm” là từ chung chỉ những người tham gia đánh giá cảm quan trong một thí nghiệm nào đó, còn từ “hội đồng” thường để chỉ một nhóm được thành lập từ những “chuyên gia” tham gia thử nếm định kì đối với một loại sản phẩm. Số lượng thành viên trong một nhóm phụ thuộc dạng đánh giá mà nhóm sẽ thực hiện, thường là không dưới 5 người. Trước khi đánh giá một sản phẩm, nhóm sẽ được lựa chọn, thành lập và huấn luyện.
- 24. 25 Hội đồng cảmquan phải có ít nhất là 5 người và nhiều nhất là 12. Ưu tiên chọn cảm quan viên với số lượng lẻ. Hội đồng phải có chủ tịch và thư kí để lãnh đạo trong quá trình làm việc. Trong trường hợp ít người, cán bộ của phòng cảm quan có thể là thư kí hội đồng, người này có thể hoặc không tham gia đánh giá. Hội đồng hoạt động trên tinh thần thay thế một phòng thí nghiệm để đánh giá các chỉ tiêu của sản phẩm. Kết quả đành giá chỉ có giá trị trên mẫu đã được đánh giá. Phiếu kết quả phải được thủ trưởng cơ quan tổ chức hôi đồng xác nhận và không được phép sửa đổi. 2.4.6. Huấn luyện cảm quan viên 2.4.6.1. Huấn luyện cơ bản Nhằm trau dồi kĩ năng nhậ định và so sánh các sai biệt rất nhỏ về màu sắc, mùi, vị và được thực hiện nhiều lần với các bước sau: - Nhận biết 4 vị cơ bản: Xếp cường độ cảm giác tăng dần theo nồng độ các chất gây vị, xác định cường độ vị của chất tan trong hỗn hợp dung dịch so với dung dịch đơn chất… - Nhận biết các mùi thông thường (khoảng 20 loại tinh dầu thực vật), khi ở dạng đơn chất và trong hỗn hợp pha trộn khác nhau. So sánh cường độ mùi ở nồng độ khác nhau. - Sắp xếp theo thứ tự tăng dần của màu sắc khi nồng độ chất tan thay đổi (màu tím, vàng, xanh, nâu) hoặc tỉ lệ màu phối trộn thay đổi. - Sắp xếp theo thứ tự tăng dần về khối lượng, độ ráp, độ cứng, độ dẻo của các dãy mẫu thí nghiệm. 2.4.6.2. Tuyển lựa và bồi dưỡng nghiệp vụ cho các cảm quan viên Trước hết các cảm quan viên phải giải được các bài kiểm tra cơ bản nêu trên. Muốn được tuyển lựa là cảm quan viên có quyền tham gia vào một hội đồng cảm quan một sản phẩm nào đó, cảm quan viên còn phải đạt được các điều kiện do cơ quan tổ chức hội đồng qui định. Sau khi được tuyển lựa, cảm quan viên phải được tiếp tục huấn luyện thường xuyên bằng cách tham gia cac hoạt động của hội đồng cảm quan. Thỉnh thoảng nên có chương trình huấn luyện đặc biệt. Tùy theo trình độ của kiểm nghiệm viên, có thể chuẩn bị các bài huần luyện dựa trên các phương pháp đã nêu trên. Việc huấn luyện các kiểm nghiệm viên và bố trí họ luân phiên nhau tham gia đánh giá trong các hội đồng nhằm nâng cao chất lượng cảm quan của hội đồng, đặc biệt trong các phương pháp sai biệt. Có nhiều nguyên lí lựa chọn và huần luyện thành viên phân tích cảm quan thực phẩm. Sau đây là Nguyên lí SPENCER, việc lựa chọn được tiến hành theo 3 bước, nếu làm được bước trước mới được làm bước sau: Bước 1: Người thử nhận 4 dung dịch: - Đường: 20g/l - Acid citric: 0,7g/l - Muối ăn: 2g/l - Cafeine: 0.7g/l Sau khi thử phải trả lời đúng 4 vị cơ bản nhận được đối với dung dịch tương ứng. Không được phép sai.
- 25. 26 Bước 2: Sosánh cường độ vị ngọt theo nồng độ của 4 dung dịch đường: 70, 100, 125, 150 g/l. không được phép sai. Bước 3: Người thử nhận một lúc 20 mẫu chất thơm khác nhau, ngửi và ghi ra giấy tên những mùi nhận được trong 15 phút. Phải nhận đúng ít nhất 11 mùi mới được mời vào nhóm thử cảm quan. 2.4.7. Các bước tiến hành đánh giá cảm quan 2.4.7.1. Kiểm tra sức khỏe thường xuyên Cả Hội đồng phải dự các cuộc kiểm tra này kể cả chủ tịch. Nếu thư kí không tham gia đánh giá thì không cần kiểm tra. Cán bộ phòng thí nghiệm tổ chức kiểm tra rồi thông báo kết quả kiểm tra ngay cho những người dự kiểm tra biết. Những người không đủ điều kiện để đánh giá ngày hôm đó, không được tham gia đánh giá. Người tổ chức hội đồng chú ý phải mời số người nhiều hơn 5 để dự phòng có người bị ốm không đánh giá được. Hội đồng vẫn đủ số người tối thiểu để đánh giá. 2.4.7.2. Vệ sinh cá nhân và phương tiện làm việc Các phương tiện làm việc và phòng ốc phải sạch sẽ và được chuẩn bị đầy đủ. Cán bộ phòng thí nghiệm và những người đánh giá phải vệ sinh cá nhân, rửa tay, súc miệng trước khi làm việc. 2.4.7.3. Tại phòng họp Sau khi thống nhất với cán bộ phòng thí nghiệm cảm quan, chủ tịch hội đồng thông báo cho cán bộ cảm quan các vấn đề sau đây: - Tên, loại sản phẩm - Số mẫu phải đánh giá - Tiêu chuẩn hoặc mẫu chuẩn của sản phẩm - Thống nhất một số vấn đề về kĩ thuật đánh giá và qui trình đánh giá, nếu là sản phẩm chưa quen thuộc Khi thông báo và bàn bạc, cán bộ phụ trách chuẩn bị mẫu không được để lộ cho hội đồng biết cơ sở sản xuất ra sản phẩm và các đặc điểm về sản phẩm có thể ảnh hưởng đến nhận xét sau này của hội đồng. Cùng với cán bộ phòng thí nghiệm quyết định thứ tự các mẫu đánh giá và các bài kiểm tra thường xuyên trước khi đánh giá. Thông báo các qui định chung (không được trao đổi ý kiến khi đánh giá…). 2.4.7.4. Tại phòng cảm quan Chủ tịch và các thành viên hội đồng kiểm tra xem xét lại các phương tiện, điều kiện làm việc có theo quy định chưa, thông báo cho cán bộ phòng thí nghiệm biết và bổ sung nếu thiếu. Các cảm quan viên ngồi vào vị trí và sắp xếp theo các biểu mẫu, đồ dùng cho thoải mái nhất. 2.4.7.5. Tiến hành đánh giá Việc đánh giá được thực hiện theo đúng quy trình được đề ra.
- 26. 27 Sau mỗi mẫu,mỗi cảm quan viên phải báo điểm cho thư ký Hội đồng biết bằng cách đưa bảng có ghi số điểm cho từng chỉ tiêu hoặc ghi vào phiếu và nộp sau mỗi mẫu. Nghỉ, dùng thức ăn, uống thanh vị, chờ đánh giá mẫu tiếp. Sau mỗi nhóm sản phẩm, cần nghỉ 15 phút hoặc sau 1 giờ đánh giá cần nghỉ 20 đến 30 phút. Cả Hội đồng phải nghỉ ở phòng họp để cán bộ phòng thí nghiệm chuẩn bị tại phòng thí nghiệm và các điều kiện làm việc. 2.4.8. Các bước tiến hành đánh giá cảm quan Quy trình kiểm nghiệm cảm quan một sản phẩm cụ thể nhằm cụ thể hóa TCVN 3215-79 đối với sản phẩm đó. Các Hội đồng nhất thiết phải có quy trình mới tiến hành đánh giá một sản phẩm. Thông thường, quy trình được biên soạn và ban hành dựa vào TCVN 3215-79 và các tiêu chuẩn về yêu cầu kỹ thuật của sản phẩm. Qui trình được phổ biến cho tất cả các cảm quan viên đối với mỗi sản phẩm. Khi cần thiết phải tổ chức tập huấn để thống nhất về thao tác và quen thuộc mẫu chuẩn. Thông thường quy trình kiểm nghiệm cảm quan gồm các phần sau: 2.4.8.1. Phạm vi áp dụng: Sơ lược phân loại sản phẩm 2.4.8.2. Quy trình cảm quan • Mẫu • Phòng cảm quan • Dụng cụ • Danh mục chỉ tiêu và hệ số quan trọng • Chuẩn bị mẫu thử • Chuẩn bị thanh vị • Tiến hành thử • Bảng điểm • Xử lý và báo cáo kết quả
- 27. 28 CHƯƠNG 3 PHÂN TÍCHLÝ HÓA 3.1. Ý nghĩa của việc lấy mẫu Trong các loại thực phẩm, hàm lượng nước rất khác nhau: 10-20% trong ngũ cốc, 60-75% trong thịt, 80-90% trong quả và rau tươi, 90-95% trong nấm ăn. Nước không phải là hợp chất cung cấp năng lượng mà ngược lại nước làm cho chất lượng của thực phẩm bị giảm đi trong quá trình bảo quản. Do đó người ta thường tìm cách làm giảm lượng nước trong chúng đến mức tối đa. Thông thường đối với các sản phẩm thực phẩm, người ta cần biết hàm lượng nước của chúng vì những lý do sau: - Về yêu cầu công nghệ, muốn biết lượng nước để có quyết định và biện pháp hợp lý về thu hoạch, phơi sấy, bảo quản và chế biến công nghiệp. Hàm lượng nước là chỉ số cần thiết để đánh giá và làm chủ được các nguy cơ gây hư hỏng trong thời gian cất giữ thực phẩm. - Về yêu cầu của việc đánh giá chất lượng, muốn biết cụ thể hàm lượng nước để quy các kết quả phân tích các chỉ tiêu về một cơ sở cố định là chất khô hay hàm lượng nước chuẩn. - Về yêu cầu về thương mại, các hợp đồng mua bán thường có quy định giới hạn trên của hàm lượng nước không cho phép trong một thực phẩm. - Về yêu cầu của quy chế, vì lý do vệ sinh thực phẩm và trung thực trong thương mại, người ta quy định hàm lượng nước giới hạn hay hàm lượng chất khô tối thiểu của một thực phẩm. Độ ẩm của một sản phẩm thực phẩm là hàm lượng nước có trong 100 gam sản phẩm. Chất khô hay bã khô là tất cả những gì còn lại sau khi tách độ ẩm từ mẫu nghiên cứu. Vì vậy xác định độ khô có thể suy ra được độ ẩm và ngược lại. 3.2. Các phương pháp xác định độ ẩm 3.2.1. Phương pháp sấy mẫu ở nhiệt độ vừa phải Phương pháp này có thể dùng cho các thực phẩm dạng rắn. Thường sấy sản phẩm trong một khí quyển có độ ẩm tương đối bằng không. Nước được kéo ra khỏi mẫu sản phẩm đã được nghiền nhỏ, để ở nhiệt độ vừa phải (50-800 C), dưới áp suất thấp, nhờ một tác nhân hút ẩm có khả năng tạo được một độ ẩm tương đối bằng không ở trong lòng. Việc cân bằng với áp suất khí quyển có áp suất hơi nước bằng không có thể nhận ra được thông qua sự không thay đổi của khối lượng mẫu trong giới hạn xác định. Thực tế có thể tạo được áp suất hơi nước bằng không bằng cách dùng những chất rất háo nước như P2O5. Việc tạo ra ngay ban đầu một áp suất thấp mà không phải bơm liên tục sẽ làm
- 28. 29 giảm nguy cơoxy hóa các chất sẽ dễ dàng làm cho sự di chuyển các phân tử nước từ mẫu vật đến chất hút nước vốn đạt được trực tiếp với nó. Khi gia nhiệt sẽ làm tăng nhanh quá trình nhả nước từ mẫu vật. Tuy nhiên nhiệt độ tối đa thường trong khoảng 45-800 C có khi đến 1000 C tùy theo sản phẩm. 3.2.2. Phương pháp sấy khô đến khối lượng không đổi (sấy nhiệt độ từ 100-1300 C) 3.2.2.1. Nguyên lý Dựa vào khả năng tách rời hơi nước và các chất dễ bay hơi khỏi mẫu trong cùng một áp suất và nhiệt độ. Dùng sức nóng làm bay hơi nước trong sản phẩm thực phẩm. 3.2.2.1. Tiến hành Chén sứ được sấy khô ở 1100 C đến trọng lượng không đổi. Để nguội trong bình hút ẩm rồi đem cân chén trên cân phân tích, chính xác đến 0,001g. Cân chính xác 2-10 g mẫu trong chén sấy. Cho chén sấy đựng mẫu vào tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 1050 C – 1100 C, trong 2 giờ. Lấy chén ra cho vào bình hút ẩm và đem cân. Tiếp tục sấy chén trong tủ sấy tiếp 30 phút, lấy ra để nguội ở bình hút ẩm và đem cân. Làm như vậy cho đến khi kết quả của 2 lần cân cuối gần như không thay đổi. Ghi kết quả của lần cân cuối cùng. 3.2.2.3. Tính kết quả Độ ẩm của mẫu được tính bằng % theo công thức: %W = 100 . G G G G 1 2 1 − − Trong đó: G1: Trọng lượng của chén và mẫu trước khi sấy (g) G2: Trọng lượng của chén và mẫu sau khi sấy (g) G: Trọng lượng của chén sấy (g) Chú ý: Đối với một số sản phẩm khó sấy khô, để rút ngắn thời gian sấy cần nghiền nhỏ hay thái mỏng, có thể sử dụng nhiệt độ sấy là 1300 C hoặc trộn lẫn với cát khô sạch (đã xử lý bằng HCl) trong khi sấy. Đối với những sản phẩm có nhiều nước thì phải làm bốc hơi trên nồi cách thủy đến kiệt nước sau đó mới cho vào tủ sấy. 3.2.3. Phương pháp chưng cất với dung môi Thông thường người ta chỉ áp dụng phương pháp này cho những sản phẩm tự khuếch tán được trong chất lỏng dùng để kéo cất. Với một số loại sản phẩm như đồ hộp, ngoài nước còn chứa một lượng chất dễ bay hơi như axit, este, tinh dầu…do đó nếu xác định độ ẩm theo phương pháp sấy khô đến trọng lượng không đổi sẽ gặp sai số lớn. Phương pháp này có thể áp dụng để xác định nước trong bơ, dầu, các sản phẩm giàu chất béo cũng như một số giàu gia vị. Một số sản phẩm chứa nhiều đường khi sấy sẽ bị caramen hóa. 3.2.3.1. Nguyên lý Khi đun sôi dung môi đã trộn lẫn với sản phẩm, dung môi bốc hơi kéo theo nước có trong sản phẩm. Hơi dung môi và hơi nước gặp lạnh sẽ ngưng tụ thành lỏng và
- 29. 30 đọng lại ốngđo có chia vạch, đọc thể tích nước trong ống đo, từ đó tính độ ẩm có trong sản phẩm. Yêu cầu đối với dung môi: - Nhiệt độ sôi của dung môi gần bằng nhiệt độ sôi của nước - Dung môi được hòa tan hoàn toàn trong nước Có thể dùng các loại dung môi sau: Toluen: 1110 C Benzen: 800 C Xylen: 1400 C CCl4: 770 C Nhược điểm chủ yếu là không trích ly được hoàn toàn nước ở trong mẫu. 3.2.3.2. Tiến hành - Cân chính xác 5-10g mẫu cho vào bình cầu có chứa dung môi (thường là toluen). Tráng lại chén bằng toluen cho vào bình cầu. Thêm toluen vào khoảng 100-150ml. - Lắp máy cất, đun bình cầu, toluen sôi mạnh bốc hơi cuốn theo nước và ngưng tụ (điều chỉnh nguồn nhiệt sao cho 100 giọt/phút) trong ống đo có chia vạch. Tiếp tục đun đến khi mức nước ở ống đo (lớp nước nằm ở dưới lớp toluen) không đổi, ngưng đun. Để nguội, đọc thể tích nước (ml) trong ống đo. 3.2.3.3. Tính kết quả Độ ẩm được tính bằng % theo công thức % W = m N .100 (%) Trong đó: N: khối lượng nước ở ống đo (suy từ thể tích nước đọc được) (g) m: khối lượng mẫu (g) 3.3. Xác định hàm lượng tro 3.3.1. Hàm lượng tro toàn phần (tro cacbonat) 3.3.1.1. Nguyên lí Dựa vào khả năng tách được các chất hữu cơ dễ cháy ra khỏi các chất hữu cơ không cháy trong mẫu phân tích ở nhiệt độ cao. Nung cháy hoàn toàn các chất hữu cơ trong sản phẩm thực phẩm ở nhiệt độ cao. Cân phần tro còn lại sẽ tính được hàm lượng tro có trong thực phẩm. 3.3.1.2. Tiến hành - Nung chén sứ đã rửa sạch trong lò nung ở 6000 C đến trọng lượng không đổi. Để nguội chén nung trong bình hút ẩm và cân trên cân phân tích (chính xác đến 0,001g). - Cân chính xác 1-3g mẫu cho vào chén nung (cho vào lo nung tăng nhiệt độ ống sinh hàn Hình 3.1. Dụng cụ chưng cất
- 30. 31 từ từ chođến 6000 C, giữ nhiệt độ này từ 3-6 giờ đến khi tro trắng. Nếu lấy ra thấy cho còn đen, làm nguội cho thêm vài giọt HNO3 nung đến trắng). - Lấy ra để nguội trong bình hút ẩm, cần tiếp tục nung khoảng 30 phút, lấy ra để nguội và cân đến khối lượng không đổi. 3.3.1.3. Tính kết quả Hàm lượng tro toàn phần tính bằng % theo công thức Hàm lượng tro = 100 . m m m m 0 1 0 2 − − Trong đó: m0: khối lượng của chén nung (g) m1: khối lượng của mẫu và chén trước khi nung (g) m2: khối lượng của chén và tro sau khi nung (g) Chú ý: - Khi xác định tro đối với các sản phẩm dễ bốc cháy (đường, mỡ…) phải đun nhẹ trên bếp điện trước khi cho đến khi thành than đen không bốc cháy nữa nới cho vào lò nung. - Nếu là sản phẩm lỏng phải cô đặc đến khô mới cho vào lò nung. - Khi chén nung còn nóng cho vào bình hút ẩm, phải hé nắp bình, để chén nung nguội bớt mới đóng kín nắp bình. 3.3.2. Hàm lượng tạp chất Những chất bẩn đất, cát lan vào trong thực phẩm là những chất có thành phần tro toàn phần của thực phẩm nhưng không tan trong HCl gọi là tạp chất hay tro không tan trong HCl. 3.3.2.1. Nguyên lý Lấy tro toàn phần cho vào HCl, sau đó lọc, phần tro không tan được nằm lại trên giấy lọc, đem rửa sạch, nung và cân. Từ đó tính toán được hàm lượng tạp chất. 3.3.2.2. Tiến hành - Nung mẫu đến tro trắng (tro toàn phần), lấy ra để nguội, thêm vào 30 ml HCl 10%. - Đun cách thủy chén tro trong 30 phút. - Lọc qua giấy lọc không tàn, rửa sạch cặn trên giấy lọc bằng nước cất đun sôi cho đến khi nước lọc không còn Cl- (kiểm tra bằng AgNO3 10%). - Đưa giấy lọc vào lại chén nung trên, nung trong lò nung ở 5500 C đến khi trọng lượng không đổi. Lấy ra để nguội trong bình hút ẩm và cân. 3.3.2.3. Tính kết quả Hàm lượng tạp chất tính bằng % theo công thức: X = 100 . m m m m 0 1 0 2 − − (%) Trong đó: m0: khối lượng của chén nung m1: Khối lượng của chén + mẫu trước khi nung (g) m2: Khối lượng của chén +tạp chất sau khi nung (g)
- 31. 32 3.4. Xác địnhhàm lượng glucid Glucid là chất hữu cơ thường chiếm từ 85 – 90% chất khô của thực vật, trong các loại hạt và bột ngũ cốc glucid thường chiếm từ 60 - 80 %. Xác định glucid trong lương thực, thực phẩm là xác định tổng số các đường và tinh bột. Sự xác định dựa trên nguyên tắc các glucid đều có thể bị axit thủy phân thành glucozơ, rồi định lượng đường glucozơ và suy ngược lại sẽ tính được glucid. Đường có trong các mặt hàng thực phẩm dưới các dạng khác nhau và với hàm lượng cũng khác nhau. trong các thực phẩm nói chung hàm lượng đường có trong bản thân nguyên liệu sẵn có hay trong quá trình chế biến tạo nên và cũng có những mặt hàng như bánh, kẹo nguyên liêuh chính là đường. Khi phân tích hàm lượng đường trong thực phẩm, người ta phân thành các loại đường như sau: đường chung (đường tan) bao gồm đường khủ và đường không khử. Đường chung được tách ra từ sản phẩm khi ta dung nước hay dung môi để hòa tan. 3.4.1. Đường khử Đường khử là đường có tính khử mà trong phân tử của chúng có chứa nhóm aldehyt, hay nhóm – OH glucozid. Ví dụ: glucozơ, Fructozơ, mantozơ, lactozơ… 3.4.1.1. Phương pháp Bertrand * Nguyên lý Trong môi trường kiềm , đường khử dễ dàng khử ion Cu2+ trong dung dịch Felin tạo thành Cu+ dưới dạng Cu2O kết tủa đỏ gạch. Dung dịch Felin gồm: Dung dịch Felin A: CuSO4 Dung dịch Felin B: NaOH, Kali natri tactrat Phản ứng xảy ra khi trộn chung 2 dung dịch Felin A và Felin B CuSO4 + 2NaOH Cu(OH)2 + Na2SO4 Cu(OH)2 + +2H2O Đường khử khử hỗn hợp Felin R–CHO + +2H2O → Cu2O +2 +RCOOH Hòa tan Cu2O kết tủa bằng dung dịch Fe2(SO4)3 trong môi trường H2SO4 đậm đặc: Cu2O + Fe2(SO4)3 + H2SO4 → 2CuSO4 + 2FeSO4 + H2O Dùng chất chuẩn KMnO4 0,1N để chuẩn độ lượng FeSO4 tạo thành: 2 KMnO4 +10 FeSO4 + 8H2SO4 → K2SO4+5 Fe2(SO4)3 + 2MnSO4 +8H2O CH CH COONa COOK O O Cu CH CH COONa COOK HO HO 2Cu ↑ CH CH HO COOK COOK HO CH CH COOK COOK O O Cu Na Na →
- 32. 33 Tại thời điểmkết thúc định phân, dung dịch có màu hồng. Từ lượng KMnO4 0,1N tiêu tốn sẽ tính được hàm lượng đường khử. Chú ý: - Trong các dung dịch thực phẩm để xác định hàm lượng đường khử thường có chứa một số tạp chất có tính khử do đó làm kết quả sai số. Do đó trước khi xác định hàm lượng đường khử cần phải tẩy tạp chất. - Thông thường để tẩy tạp chất dùng axetat chì. Axetat chì có tác dụng kết tủa hầu hết các chất phi đường. - Axetat chì được dùng dưới dạng bột hay dung dịch 20% hoặc 30%. * Tiến hành Chuẩn bị mẫu: - Cân chính xác G(g) mẫu vào cốc thủy tinh (G: tùy thuộc vào từng loại mẫu phân tích). Hòa tan hoàn toàn bằng nước cất. Chuyển sang bình định mức 100ml. Tráng cốc bằng nước cất cho vào bình định mức trên. Thêm nước cất đền vạch định mức. - Thêm một ít axetat chì bột (1,5g) lắc đều và lọc qua giấy lọc. Hứng dung dịch lọc vào cốc khô sạch (gọi là dung dịch mẫu). Tạo kết tủa: - Cho vào bình nón 250 ml: 10 ml dung dịch mẫu, 10 ml felin A và 10 ml felin B, lắc nhẹ. - Đặt bình nón lên trên bếp điện, đun sôi, sôi đúng 3 phút. - Lấy bình nón ra để nghiêng cho kết tủa lắng xuống. Dung dịch bên trên lớp kết tủa Cu2O phải còn màu xanh của Cu2+ . Nếu mất màu xanh nghĩa là không đủ lượng Cu2+ cần thiết để phản ứng. Do đó, phải làm lại với thể tích dung dịch lọc ít hơn (5 ml), nhưng phải thêm nước cất cho đủ 10 ml. Gạn lọc kết tủa: - Khi kết tủa Cu2O lắng xuống, gạn phần nước bên trên và lọc qua phễu lọc xốp cắm xuyên qua nút cao su của bình lọc có nhánh nối với máy hút chân không. - Rửa kết tủa bằng nước đã đun sôi và gạn lọc tiếp tục vào phễu cho đến khi trong bình nón mất màu xanh. Trong quá trình gạn lọc, không để kết tủa Cu2O lọt vào phễu và luôn luôn giữ có một lớp nước trên mặt Cu2O để tránh tiếp xúc với không khí. Hòa tan kết tủa: - Lần cuối cùng gạn hết nước và cho ngay 10 – 20 ml Fe2(SO4)3 và H2SO4 đặc để hòa tan Cu2O trong bình nón. - Thay bình lọc hút bằng bình lọc hút khác. Đổ dung dịch Fe2(SO4)3 đã hòa tan Cu2O cho đến khi không còn vết Cu2O trong bình nón và phễu. Tráng phễu, rửa lại gắn với máy hút chân không Hình 3.2. Bộ lọc chân không
- 33. 34 bằng nước cấtđun sôi rồi đổ cả vào phễu và hút hết xuống bình lọc. Chuẩn độ: Lấy bình lọc hút ra và chuẩn độ ngay bằng KMnO4 0,1M cho đến khi xuất hiện màu hồng bền trong 30 giây. * Tính kết quả Hàm lượng đường khử được tính bằng % theo công thức: (%) 1000 . V . G V . 100 . a R 0 s = Trong đó: a: lượng glucoza tìm được theo bảng tra từ số ml KMnO4 tiêu tốn (mg) (bảng tra lượng glucose xem phần phụ lục) V0: thể tích bình định mức V: thể tích dung dịch lấy để thử (ml) G: lượng cân mẫu (g) Ví dụ tính toán về cách tính a khi tra bảng Khi chuẩn dùng hết 3,7 ml KMnO4 0,1N. tính a (mg) Tra bảng ta có: 3,55 ml KMnO4 0,1 N → 11 mg Glucozơ 3,87 ml KMnO4 0,1 N → 12 mg Glucozơ Dùng phương pháp nội suy ta tính: a = 11 + ) 55 , 3 87 , 3 ( ) 55 , 3 7 , 3 ).( 11 12 ( − − − = 11,46 mg Glucozơ 3.4.1.2. Phương pháp metylen xanh (Bectơrăng trực tiếp) Đối với một số sản phẩm có hàm lượng đường khử thấp, người ta dùng phương pháp Bectơrăng trực tiếp. * Nguyên lí Đường khử có khả năng khử làm mất màu metylen xanh. Vì vậy dùng metylen xanh làm chất chỉ thị cho phản ứng oxy hóa đường khử bằng Felin. Cho vài giọt metylen xanh vào dung dịch và đun sôi, rồi nhỏ từng giọt đường khử vào, đầu tiên đường khử sẽ khử đồng đẳng của Felin, màu của metylen xanh không đổi. Khi tất cả đồng đẳng của Felin đã bị khử hết, đường sẽ khử metylen xanh làm nó mất màu, đó là dấu hiệu kết thúc định phân. Yêu cầu:Tiến hành định phân nhanh và luôn giữ trạng thái dung dịch sôi ổn định vì hợp chất dễ bị oxy hóa và trở về trạng thái màu ban đầu. * Tiến hành - Chuẩn bị mẫu: giống phương pháp Bertrand. - Lấy dung dịch mẫu đã chuẩn bị cho vào buret. - Cho vào bình nón 250 ml: 5 ml felin A, 5 ml felin B và 20 ml nước cất, lắc nhẹ. Đặt bình nón lên trên bếp và đun nhanh đến sôi. Tiếp tục đun sôi trong 2 phút, thêm 3 – 5 giọt metylen xanh, dung dịch phải có màu xanh. Nếu dung dịch không có màu xanh, chứng tỏ lượng đường trong mẫu quá lớn, cần bớt lượng mẫu.
- 34. 35 - Để buretcao hơn bình 2 -3 cm. tiếp tục dịnh phân, giữ cho bình sôi mạnh và không nâng bình lên khỏi bếp cho đến khi mất màu xanh hoàn toàn. Lắc đều mỗi khi cho dung dịch đường vào (chú ý không làm gián đoạn sự sôi). Quá trình định phân sau khi cho thêm metylen xanh vào kéo dài 1 phút. - Dùng lượng dung dịch định phân này để là số liệu sơ bộ cho lần sau. - Lần thí nghiệm sau cho gần hết lượng mẫu tiêu tốn ở trên vào bình trước khi đun sôi chỉ chừa lại 1 – 2 ml để định phân kết thúc trên bếp, bảo đảm thời gian định phân nhanh. Ghi số ml dung dịch mẫu tiêu tốn là V (ml). - Làm thí nghiệm như trên nhưng chuẩn bằng glucose tiêu chuẩn. - Ghi số ml glucose tiêu chuẩn 0,5 % đã tiêu tốn là f (ml). * Tính kết quả Hàm lượng đường khử của mẫu được xác định bằng % theo công thức: (%) G 100 . V V . f . 100 5 , 0 R 0 S = Trong đó: f: thể tích glucoza tiêu chuẩn 0,5 % tiêu tốn (ml) V0: thể tích bình định mức (ml) V: thể tích dung dịch mẫu tiêu tốn (ml) G: lượng cân mẫu 3.4.2. Đường Saccazozơ 3.4.2.1. Nguyên lí Đường Saccarozơ là đường không có tính khử do nó không khử được dung dịch felin. Trong môi trường acid, đường Saccharose thủy phân thành hỗn hợp đường nghịch đảo Glucose và Fructose, hỗn đường này là đường khử: C12H22O11 + H2O C6H12O6 + C6H12O6 Glucose Fructose Xác định hàm lượng đường khử này bằng phương pháp Bertrand hoặc phương pháp metylen xanh. Từ đó tính được hàm lượng đường Saccharose. Chú ý khi xác định hàm lượng đường Saccharose phải xác định hàm lượng đường khử ban đầu trước. 3.4.2.2. Tiến hành Chuẩn bị dịch mẫu: - Cân chính xác G(g) mẫu (1-5g), hòa tan hoàn toàn bằng nước cất, cho vào bình định mức dung tích 100ml, thêm 20 ml nước cất, 5ml HCl đậm đặc (d = 1,19g/ml). - Đặt bình vào nồi cách thủy, nhiệt độ 700 C, thời gian là 15 phút, lấy bình ra và làm nguội nhanh dưới dòng nước lạnh. - Trung hòa acid dư bằng NaOH 20% với chỉ thị phenolphtalein đến dung dịch có màu hồng. Thêm nước cất đến vạch, thêm ít acetat chì bột, lắc đều và lọc qua giấy lọc, hứng dung dịch lọc bằng cốc khô và sạch.
- 35. 36 Xác định hàmlượng đường khử: Lấy dung dịch lọc trên xác định hàm lượng đường khử bằng phương pháp Bertrand hay phương pháp Metylen xanh. 3.4.2.3. Tính kết quả Hàm lượng đường Saccarozơ được tính bằng % theo công thức: Saccarozơ = (a - b).0,95 (%) Trong đó: a: Hàm lượng đường khử sau khi thủy phân (%) b: Hàm lượng đường khử có trong mẫu trước khi thủy phân (%) Nhận xét: - So với phương pháp Bertrand, kết quả giảm 1-2% - Phương pháp này đơn giản, ít tốn thời gian - Phương pháp này được sử dụng rộng rãi trong ngành sản xuất đườngmía, đường glucozơ, sản xuất bánh kẹo và các sản phẩm lên men. 3.4.3. Tinh bột 3.4.3.1. Nguyên lý Dựa vào tính chất: ở 1000 C, với tác nhân HCl đặc, trong 3 giờ, tinh bột thủy phân hoàn toàn thành glucozơ: (C6H10O5)n + n H2O nC6H12O6 Dùng phương pháp đã học Bertrand hay Metylen xanh để xác định lượng đường khử này. Từ đó sẽ tính được hàm lượng tinh bột. Chú ý: - Trước khi xác định hàm lượng tinh bột phải xác định hàm lượng đường chung - Hàm lượng đường chung là tổng của tất cả các loại đường quy theo glucozơ - Hàm lượng đường được xác định bằng cách: thủy phân ở nhiệt độ 700 C, trong thời gian 15 phút, môi trường acid HCl đặc sau đó xác định hàm lượng đường khử sau khi đã thủy phân. 3.4.3.2. Tiến hành Chuẩn bị dịch mẫu: - Cân chính xác G(g) mẫu (1-5g), cho vào bình định mức dung tích 250ml, thêm vào 100ml nước cất lắc cho tan hoàn toàn thêm tiếp 5ml HCl đậm đặc (d = 1,19g/ml). Đậy nình bằng nút cao su có gắn ống thủy tinh dài. - Đặt bình vào nồi cách thủy, nhiệt độ 1000 C, thời gian là 3 giờ kể từ lúc bắt đầu sôi. - Lấy bình ra làm nguội nhanh dưới dòng nước lạnh đến nhiệt độ phòng. Trung hòa acid dư bằng NaOH 20% với chỉ thị phenolphtalein đến dung dịch có màu hồng. - Chuyển sang bình định mức dung tích 250 ml, dùng nước cất tráng bình nón chuyển sang bình định mức (2-3 lần), thêm nước cất đến vạch, thêm ít acetat chì bột, lắc đều và lọc qua giấy lọc, hứng dung dịch lọc bằng cốc khô và sạch.
- 36. 37 Xác định hàmlượng đường khử: Lấy dung dịch lọc trên xác định hàm lượng đường khử bằng phương pháp Bertrand hay phương pháp Metylen xanh. 3.4.3.3. Tính kết quả Hàm lượng tinh bột được tính bằng % theo công thức: X = (a – b).0,9 (%) Trong đó: a: hàm lượng đường khử sau khi thủy phân (%) b: hàm lượng đường chung tính theo glucozơ (%) 3.4.4. Đường tổng số (glucid) Xác định hàm lượng Glucid là xác định tổng số bao gồm các loại đường và tinh bột. Cách xác định: giống cách xác định tinh bột Tính kết quả: Quy theo hàm lượng tinh bột Glucid = a.0,9 (%) (tinh bột) a: hàm lượng đường khử (%) sau khi đã thủy phân 1000 C, 3 giờ, HCl đặc 3.5. Xác định chất béo Xác định bằng thiết bị chiết Soxhlet. Phần lớn các nguyên liệu dùng để chế biến thực phẩm đều chứa một hàm lượng chất béo nhất định. Bởi vậy, việc xác định hàm lượng chất béo là rất cần thiết. Không những nó đánh giá chất lượng nguyên liệu mà trong một số trường hợp cần phải biết hàm lượng chất béo để đặt ra quá trình xử lý công nghệ. 3.5.1. Nguyên lý − Dựa vào tính tan hoàn toàn của chất béo vào dung môi hữu cơ. − Dùng dung môi hữu cơ trích ly chất béo có trong sản phẩm thực phẩm. Sau đó làm bay hơi hết dung môi, chất béo còn lại đem cân, tính ra hàm lượng chất béo có trong sản phẩm thực phẩm. Yêu cầu của dung môi: • Chất béo phải hoàn toàn trong dung môi hữu cơ • Có nhiệt độ sôi thấp hơn nhiều so với chất béo (có thể bay hơi ở nhiệt độ thường) • Thường chọn các dung môi sau: Ống xiphông Bình cầu Ống chiết đựng mẫu Ống làm lạnh Hình 3.3. Bộ chiết Soxhlet
- 37. 38 + Ete etylic +Ete dầu hỏa (petrol) + Tetraclorua cacbon (CCl4) 3.5.2. Tiến hành Chuẩn bị mẫu và lắp hệ thống máy trích ly Soxhlet - Cân 5g mẫu đã nghiền nhỏ, cho vào ống giấy xốp hay gói bằng giấy cho vào tháp trích ly của máy Soxhlet (chú ý: đầu trên của ống giấy thấp hơn đỉnh ống xiphông của tháp trích ly). - Lắp bình cầu đã sấy khô vào máy. Qua cổ ống sinh hàn rót dung môi vào bình cầu. Lượng dung môi rót vào khoảng 2/3 thể tích bình cầu hoặc hai lần dung tích tháp trích ly. Cho nước chảy liên tục vào ống làm lạnh. Trích ly chất béo - Đun từ từ dung môi trong bình cầu bằng bếp cách thủy (nếu dung môi là CCl4 thì có thể đun trên bếp điện) - Dung môi sôi, bay hơi gặp lạnh, ngưng tụ ở tháp trích ly, trong thời gian này, dung môi sẽ trích ly chất béo, đến khi dung môi trong tháp trích ly vượt quá đầu ống xiphông sẽ tràn về bình cầu kéo theo chất béo, ta gọi là một chu trình. Dung môi lại tiếp tục bay hơi, còn chất béo do có nhiệt độ sôi cao hơn nên không bay hơi, còn chất béo do có nhiệt độ sôi cao hơn không bay hơi ở lại bình cầu, quá trình lại diễn ra tiếp tục. - Để tránh tổn thất dung môi, dung môi trong bình cầu không được sôi mạnh, đảm bảo khoảng 5 - 6 chu trình trong 1 giờ. Trong quá trình chiết cần chú ý: + Kiểm tra nước làm lạnh có chạy liên tục hay không? + Kiểm tra dung môi nếu thấy hao hụt phải gia thêm vào. + Khi cần máy nghỉ giữa chừng cần giữ ống giấy ngập trong dung môi. Muốn biết quá trình chiết đã kết thúc hay chưa, lấy túi giấy lọc ra cho nhỏ vài giọt vào mặt kính đồng hồ hoặc tờ giấy lọc, khi dung môi bay hơi hết, trên mặt kính hay mặt giấy lọc không có vết chất béo thì quá trình chiết đã kết thúc. Cất dung môi - Sau khi quá trình chiết kết thúc, bỏ túi giấy lọc ra rồi tiến hành cất dung môi ngay trong tháp để thu hồi dung môi (trường hợp nếu dung môi trong bình cầu đục, có lẫn bột nghiền thì phải lọc qua giấy lọc rồi mới cất thu hồi dung môi). - Chuyển chất béo trong bình cầu vào cốc thủy tinh (đã sấy khô và biết khối lượng). Tráng bình cầu bằng một ít dung môi trong cốc thủy tinh bay hơi ở nhiệt độ thường (chú ý tránh bụi). - Sau đó cho cốc thủy tinh vào tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 100-1050 C trong 1 giờ, lấy ra để nguội ở bình hút ẩm và cân, sấy tiếp trong 30 phút, sấy đến trọng lượng sai lệch nhau không quá 0,002gam là được. 3.5.3. Tính kết quả Hàm lượng chất béo trong mẫu tính bằng % theo công thức:
- 38. 39 H2SO4 đđ, t0 CuSO4,K2SO4 Chất béo = (%) 100 . G m m 2 1 − Trong đó: m1: khối lượng của cốc (g) m2: khối lượng của cốc và khối lượng của chất béo sau khi sấy(g) G: khối lượng mẫu (g) 3.6. Xác định protid 3.6.1. Xác định hàm lượng Nitơ tổng số Xác định bằng phương pháp Kjendanl trên máy cất đạm Pacnat Vacne (Panazz- Wagner). Trong thực phẩm, những hợp chất có chứa nitơ thường ở dưới dạng protit, acid amin, peptit…ngoài ra còn có một số chất khác như: amit, muối amoni… Xác định hàm lượng nitơ toàn phần là xác định hàm lượng N trong tất cả các hợp chất có chứa nitơ. 3.6.1.1. Nguyên lý Các chất protit được vô cơ hóa bằng axit sunfuric đậm đặc (H2SO4 đ). Làm xúc tác cho quá trình vô cơ hóa là đồng sunfat, H2O2, thủy ngân, selen, kali pemanganat và các hỗn hợp khác. Dùng kali sunfat hay natri sunfat để làm tăng nhiệt độ sôi của acid sunfuric, đẩy nhanh quá trình oxi hóa. Sản phẩm của sự vô cơ hóa protit là amoniac: CxHyOzNt + O2(KK) NH3↑ + SO2↑ + CO2↑ +H2O + NH3↑ vừa mới sinh ra tác dụng ngay với H2SO4 đđ 2 NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4 + Dùng kiềm mạnh đẩy (NH4)2SO4 ra dạng tự do: 2NaOH đđ + (NH4)2SO4 → 2NH3 + Na2SO4 + H2O + Cất NH3, dùng H2SO4 0,1N (đã biết trước thể tích) để hấp phụ NH3 + Chuẩn lượng H2SO4 0,1N dư bằng NaOH 0,1N + Từ lượng NaOH 0,1N tiêu tốn tính lượng Nitơ + Sau khi tính được hàm lượng Nitơ, muốn tính hàm lượng protit toàn phần trong thực phẩm, ta tính như sau: K = 5,7 Lúa mì, đậu K = 6,0 Ngô K= 6,25 Thực phẩm có nguồn gốc động vật K= 6,38 Sữa K = 8,0 Khoai tây Protit toàn phần = K . hàm lượng Nitơ toàn phần
- 39. 40 Hình 3.4. Vôcơ hóa mẫu trong bình Kiendan 3.6.1.2. Tiến hành Lấy mẫu Tùy hàm lượng protein có trong thực phẩm hoặc tùy theo dạng sản phẩm cách lấy mẫu như sau: Sản phẩm khô Hàm lượng protein nhiều: cân 0,3 – 0,5g mẫu trên cân phân tích. Hàm lượng protein ít : cân 1 – 2g mẫu trên cân phân tích. Sản phẩm khô sau khi cân gói vào giấy lọc không tro, cho vào bình hút ẩm. Sản phẩm ướt Tùy mẫu có ít hay nhiều protein mà cân lượng mẫu, thường cân 1g vào cốc. Chuyển mẫu vào bình Kiendan, cho nước cất tráng cốc và cho vào bình Kiendan (dùng càng ít nước càng tốt). Sản phẩm lỏng (nước mắm, nước chấm…) Dùng pipet lấy chính xác 2 - 5 ml mẫu cho vào bình Kiendan (hình 3.4). Vô cơ hóa mẫu - Thêm vào bình Kiendan đã chứa mẫu 1g K2SO4, 2g CuSO4, 3ml H2SO4 đậm đặc, dùng ít nước sạch tráng sạch cổ bình, đặt miệng phễu lên miệng bình Kiendan, cặp bình Kiendan vào giá, đáy bình đặt nghiêng một góc 450 đặt trên bếp điện hay đèn cồn. - Đun nhẹ, sau vài phút chuyển sang đun mạnh cho đến khi toàn bộ dung dịch trong bình Kiendan có màu xanh của sunfat đồng hay xanh vàng thì ngừng. - Để nguội bình đến nhiệt độ phòng, chuyển sang bình định mức 100 ml, tráng bình Kiendan bằng nước cất rồi thêm nước cất đến vạch định mức, lắc đều. Cất mẫu Tiến hành trên máy cất đạm. - Đun xong, để nguội rồi lắp bình Hình 3.5. Máy cất đạm a. Bình cầu b. Bình bảo hiểm c. Bình cất d. Ống sinh hàn e. Phễu f. Bình tam giác g. Đèn cồn g f
- 40. 41 Kiendan vào máycất đạm. - Hút 20ml H2SO4 0,1N cho vào bình tam giác f 250ml, 5 – 10 ml nước cất và 2-3 giọt chỉ thị fenolftalein rồi đặt bình vào đầu dưới sinh hàn của máy cất đạm, sao cho đầu ống sinh hàn phải nhúng ngập vào dung dịch trong bình tam giác. - Dùng pipet lấy 10ml dung dịch ở bình định mức cho vào bầu cất c của máy cất đạm, thêm vào 10 – 15 ml NaOH 30% (nhỏ vào 5 giọt chất chỉ thị fenolftalein 0,1% và cho từ từ NaOH 30% qua phễu vào bình cất, nếu dung dịch trong bình cất chưa chuyển qua màu hồng thì cho thêm NaOH đến khi xuất hiện màu hồng đậm), nút kín. - Cho nước cất vào khoảng 2/3 thể tích bình cầu a, mở nước làm lạnh chảy vào ống làm lạnh. - Đun sôi dung dịch trong bình cầu khoảng 20 – 25 phút, dùng giấy quỳ thử khi nước ngưng thoát ra không còn phản ứng kiềm là được. Cất xong dùng bình tia rửa sạch acid bám ở ống ngưng nhúng trong bình tam giác. Chuẩn độ: Chuẩn độ lượng H2SO4 0,1N dư trong bình tam giác bằng NaOH 0,1N đến khi dung dịch trong bình tam giác chuyển sang màu hồng. Cất mẫu trắng Cất một mẫu trắng với lượng thuốc thử và thao tác như trên nhưng thay 100ml dung dịch trong bình định mức bằng 10ml nước cất. 3.6.1.3. Tính kết quả Hàm lượng nitơ toàn phần được tính theo công thức: + Đối với sản phẩm khô hay ướt: (%) V . G V 100 . 0014 , 0 ). V V ( X 0 2 1 − = + Đối với sản phẩm lỏng: ' V . V V 100 . 0014 , 0 ). V V ( X 0 2 1 − = (g/ml) Trong đó: V0 : thể tích bình định mức (ml) V’ : thể tích dung dịch mẫu lấy để cất (ml) V1 : số ml NaOH 0,1N tiêu tốn để chuẩn mẫu trắng V2 : số ml NaOH 0,1N tiêu tốn để chuẩn mẫu thử V : số ml mẫu phân tích G : lượng cân mẫu (g) 0,0014: lượng nitơ ứng với 1ml NaOH 0,1N 3.6.2. Xác định hàm lượng Nitơ formol (Nitơ foocmon) 3.6.2.1. Nguyên lý Xác định hàm lượng nitơ foocmon là xác định hàm lượng tống số các axit amin và muối amôni có trong thực phẩm. Trong thực tế, lượng muối amoni là rất ít, nên có thể xem như xác định nitơ foocmon chủ yếu là xác định các acid amin. Trong các phân tử acid amin đều có chứa nhóm amin và nhóm cacboxyl
- 41. 42 R C COOH NH2 +HCHO R C COOH N CH2 H H + H2O (-COOH) có tính acid, nên trong dung dịch nó không thể hiện rõ tính acid hay bazơ. Nếu cho acid amin tác dụng với foocmon thì nhóm amin sẽ kết hợp với foocmon thành nhóm – N = CH2 (metylenic) làm cho tính bazơ yếu đi rõ rệt và tính axit tăng lên rõ rệt. Do đó có thể chuẩn độ được bằng chất chuẩn kiềm và chất chỉ thị axit – bazơ để kết thúc quá trình định phân. Các phản ứng xảy ra: + Phản ứng giữa axit amin và foocmon: Để phản ứng này xảy ra hòa toàn thì pH phải nằm trong khoảng 9,1 – 9,6 + Phản ứng chuẩn độ bởi kiềm : + Nếu trong sản phẩm có muối amoni thì nó cũng tác dụng với Foocmon tạo thành acid: 4NH4Cl + 6HCHO → 4HCl + (CH2)6N4 + 6H2O Acid tạo thành cũng tác dụng với kiềm khi chuẩn độ Để kết thúc quá trình chuẩn độ, người ta chọn chất chỉ thị. Tùy thuộc vào chất chỉ thị ta có các phương pháp Sorensen hay phương pháp chỉ thị hỗn hợp. 3.6.2.2. Phương pháp Sorensen Phương pháp Sorensen dùng phenolphtalein làm chất chỉ thị, điểm tương đương để chuẩn độ các acid amin bằng NaOH đến màu đỏ thắm, nhằm đảm bảo điểm kết thúc định phân nằm trong khoảng pH = 9,1 – 9,6. Trong điều kiện này, người ta coi nhóm cacboxyl được chuẩn độ bằng kiềm chính là số phân tử axit amin trong mẫu. Đối với các acid amin đi cacboxylic (acid glutamic, axit aspatic…) thì phải trung hòa trước nhóm cacboxylic tự do đến pH = 7. Từ lượng NaOH 0,2N đã dùng để chuẩn độ suy ra lượng nitơ trong mẫu. Do khó nhận biết lúc chuyển màu nên thường dung dịch màu tiêu chuẩn như sau: lấy 100ml Na2 HPO4 0,1N và cho thêm 0,5ml phenolphtalein 0,1%. Tiến hành: Chuẩn bị dung dịch mẫu Sản phẩm đặc: nghiền nhuyễn, cân chính xác 3-5g mẫu cho vào bình định mức dung tích 100ml, thêm 50ml nước cất, lắc mạnh cho tan hết, thêm nước cất đến vạch định mức, lắc đều, để yên 10 phút, lọc qua giấy lọc. + NaOH R C COOH N CH2 H + H2O R C COONa N CH2 H
- 42. 43 Sản phẩm lỏng:dùng pipet lấy chính xác 10ml cho vào bình định mức 100ml, cho nước cất đến vạch định mức. Trung hòa mẫu Dùng pipet lấy chính xác 20ml dung dịch mẫu cho vào bình nón dung tích 250ml, cho tiếp 2 ml phenolphtalein 0,5%, 20ml nước cất, trung hòa dung dịch với NaOH 0,1N nếu mẫu có tính axit đến màu hồng nhạt hoặc trung hòa dung dịch mẫu với HCl 0,1N nếu mẫu có tính bazơ đến không màu và lấy lại màu hồng nhạt bằng vài giọt NaOH 0,1N. Chuẩn độ: theo 4 giai đoạn: - Giai đoạn 1: chuẩn độ dung dịch đã trung hòa bằng NaOH 0,1N từ màu hồng nhạt sang màu hồng. - Giai đoạn 2: tiếp tục chuẩn độ dung dịch bằng NaOH 0,2N từ màu hồng nhạt sang màu đỏ thắm (pH = 9,1). - Giai đoạn 3: cho 10ml foocmon trung tính dung dịch sẽ mất màu, tiếp tục chuẩn độ dung dịch bằng NaOH 0,2N đến khi có màu hồng nhạt (pH = 8,3). - Giai đoạn 4:tiếp tục chuẩn độ dung dịch bằng NaOH 0,2N từ màu hồng sang màu đỏ thắm (giống màu tiêu chuẩn) (pH = 9,6). Tính kết quả: Hàm lượng Nitơ foocmon được tính bằng công thức: + Đối với sản phẩm khô hay ướt: % GV V . 100 . 0028 , 0 . V X ' 0 = + Đối với sản phẩm lỏng: V V V . 100 . 0028 , 0 . V X m 0 = (g/l) Trong đó: V0 : thể tích bình định mức (ml) V’ : thể tích dung dịch mẫu lấy để chuẩn độ (ml) V : số ml NaOH 0,2N tiêu tốn để chuẩn Vm : số ml mẫu phân tích G : lượng cân mẫu (g) 0,0028: lượng nitơ ứng với 1ml NaOH 0,2N (g) Nhận xét: Phương pháp này có những nhược điểm sau: Người phân tích khó nhận biết được điểm tương đương do sự chuyển màu của chỉ thị không đột ngột. Do đó để nhận biết chính xác sự đổi màu của chất chỉ thị thì mắt người phân tích phải tốt, nhận biết màu đỏ thắm quen và có dung dịch chuẩn. 3.6.2.3. Phương pháp hỗn hợp chỉ thị Phương pháp này dùng chỉ thị hỗn hợp Phenolphtalein và Bromothymol xanh do đó có sự chuyển màu đột ngột dễ nhận biết.
- 43. 44 Tiến hành: - Chuẩnbị dung dịch mẫu chuẩn: giống phương pháp Sorensen. - Dùng pipet lấy 10ml dung dịch mẫu đã chuẩn bị ở trên cho vào bình tam giác có dung tích 250ml, thêm 15 giọt Bromothymol xanh 0,04%. Nếu dung dịch có màu vàng thì nhỏ thêm từng giọt NaOH đến khi xuất hiện màu xanh. - Nếu dung dịch trên có màu xanh thì nhỏ từng giọt HCl 0,1N đến khi có màu vàng rồi lại lấy màu xanh bằng vài giọt NaOH 0,1N. - Cho tiếp 5 giọt Phenolphtalein 0,5% 5ml foocmon trung tính, rồi chuẩn độ bằng NaOH 0,05N đến khi màu của dung dịch chuyển từ xanh sang tím. - Ghi thể tích NaOH 0,05N tiêu tốn. Tính kết quả: Hàm lượng Nitơ Foocmon được tính bằng công thức: + Đối với sản phẩm khô hay ướt: % GV V . 100 . 0007 , 0 . V X ' 0 = + Đối với sản phẩm lỏng: V V V . 100 . 0007 , 0 . V X m 0 = (g/l) Trong đó: V0 : thể tích bình định mức (ml) V’ : thể tích dung dịch mẫu lấy để chuẩn độ (ml) V : số ml NaOH 0,2N tiêu tốn để chuẩn Vm : số ml mẫu phân tích G : lượng cân mẫu (g) 0,0007: lượng nitơ ứng với 1ml NaOH 0,05N (g) Nhận xét: - Ranh giới chuyển màu trước và sau điểm tương đương rất rõ ràng nên kết quả ổn định. - Thời gian phân tích nhanh , điều kiện tiến hành đơn giản và ít tốn hóa chất. 3.6.3. Xác định hàm lượng đạm amoniac Đạm amoniac bao gồm các muối amoni và các loại tương tự như urê, chúng là các hợp chất phi protein được tạo thành trong quá trình chế biến và bảo quản thực phẩm do sự phân hủy của protein dưới tác dụng của men proteaza và nhiệt độ. Trong thực phẩm mà chứa nhiều đạm amoniac thì chất lượng sản phẩm kém. 3.6.3.1. Nguyên lý Dùng kiềm mạnh đẩy NH3 ra khỏi muối amoni: NH4 + + NaOH → NH3↑ + H2O + Na+ Cất NH3 trên máy cất đạm và dùng H2SO4 0,1N hấp phụ: 2NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4 Chuẩn độ lượng H2SO4 0,1N dư bằng dung dịch kiềm chuẩn NaOH 0,1N với chỉ thị hỗn hợp: H2SO4 + 2NaOH → Na2SO4 + 2H2O
- 44. 45 Chuẩn đến khidung dịch chuyển từ màu tím sang màu xanh lá mạ. Từ số ml NaOH 0,1N tiêu tốn tính được hàm lượng đạm amoniac. 3.6.3.2. Tiến hành Quá trình chuẩn bị mẫu, cất trên máy cất đạm, hấp phụ, chuẩn độ giống như phần tiến hành xác định hàm lượng nitơ toàn phần ( không qua quá trình vô cơ hóa mẫu). 3.6.3.3. Tính toán kết quả Giống như phần xác định nitơ toàn phần.
- 45. 46 CHƯƠNG 4 PHÂN TÍCHVI SINH 4.1. Đại cương về vi sinh vật 4.1.1. Đặc điểm chung của vi sinh vật Vi sinh vật(VSV) là tên gọi chung để chỉ tất cả các sinh vật có hình thể bé nhỏ, muốn thấy rõ được người ta phải sử dụng tới kính hiển vi. Virut là nhóm VSV đặc biệt, chúng nhỏ bé tới mức chỉ có thể quan sát được qua kính hiển vi điện tử. Virut chưa có cả cấu trúc tế bào. Các VSV khác thường là đơn bào hoặc đa bào nhưng có cấu trúc đơn giản và chưa phân hóa thành các cơ quan sinh dưỡng. VSV không phải là một nhóm riêng biệt trong sinh giới. Chúng thậm chí thuộc về nhiều giới sinh vật khác nhau. Giữa các nhóm có thể không có không có quan hệ mật thiết với nhau. Chúng có chung những đặc điểm sau đây: - Kích thước nhỏ bé. Mắt con người khó thấy được rõ những vật nhỏ hơn 1nm. Vậy mà VSV thường được đo bằng μm, virut thường được đo bằng nm. Vì vi sinh vật có kích thước nhỏ bé cho nên diện tích bề mặt của một tập đoàn VSV hết sức lớn. Chẳng hạn số lượng cầu khuẩn chiếm thể tích 1cm3 có diện tích bề mặt là 6m2 . - Hấp thu nhiều, chuyển hóa nhanh. VSV tuy nhỏ bé nhất trong sinh vật nhưng năng lực hấp thu và chuyển hóa của chúng có thể vượt xa các sinh vật bậc cao. Chẳng hạn vi khuẩn lactic trong 1 giờ có thể phân giải một lượng đường lactoza nặng hơn 1.000 - 10.000 lần khối lượng của chúng. Nếu tính lượng O2 mà mỗi mg chất khô của cơ thể sinh vật tiêu hao trong một giờ (biểu thị bằng 2 O Q ) thì ở mô lá hoặc mô rễ thực vật là 0,5 - 4, ở tổ chức gan và thận động vật là 10 - 20, còn ở nấm men rượu là 110, ở vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas là 1.200, ở vi khuẩn thuộc chi Azotobacter là 2.000. Năng lực chuyển hóa sinh hóa mạnh mẽ của vi sinh vật dẫn đến những tác dụng hết sức lớn lao của chúng trong thiên nhiên cũng như trong hoạt động sống của con người. - Sinh trưởng nhanh, phát triển mạnh. So với các sinh vật khác thì VSV có tốc độ sinh trưởng và sinh sôi nảy nở cực kỳ lớn. Vi khuẩn Escherichia coli lúc điều kiện thích hợp thì cứ khoảng 12 - 20 phút lại phân cắt một lần, nếu lấy thế hệ là 20 phút thì mỗi giờ phân cắt 3 lần, 24 giờ phân cắt từ một tế bào ban đầu sẽ sinh ra 4.722.366.500.000.000.000.000 tế bào. Tất nhiên, trong thực tế không thể tạo ra các điều kiện sinh trưởng lí tưởng như vậy được cho nên số lượng vi khuẩn thu được trong 1ml dịch nuôi cấy thường chỉ đạt tới mức độ 108 - 109 tế bào. Thời gian thế hệ của nấm men Saccharon cerevisiae là 120 phút. Khi nuôi cấy để thu nhận sinh khối (biomass) giàu protein phục vụ chăn nuôi, người ta nhận thấy tốc độ sinh tổng hợp của
- 46. 47 nấm men nàycao hơn của bò tới 100.000 lần. Thời gian thế hệ của tảo Chlorella là 7 giờ, của vi khuẩn lam Nostoc là 23 giờ. - Năng lực thích ứng mạnh và dễ phát sinh biến dị. Năng lực thích ứng của VSV vượt rất xa so với động vật và thực vật. Trong quá trình tiến hóa lâu dài, VSV đã tạo cho mình những cơ chế điều hòa trao đổi chất để thích ứng được với những điều kiện sống rất bất lợi. Người ta nhận thấy số lượng enzim thích ứng chiếm tới 10% lượng chứa protein trong tế bào sinh vật. Sự thích ứng của vi sinh vật nhiều khi vượt quá sự tưởng tượng của con người. Phần lớn vi sinh vật có thể giữ nguyên sức sống ở nhiệt độ của nitơ lỏng (-1960 C), thậm chí ở nhiệt độ hidro lỏng (-2530 C). Một số vi sinh vật có thể sinh trưởng ở nhiệt độ 2500 C, thậm chí 3000 C. Một số vi sinh vật có thể thích nghi với nồng độ 32% NaCl (muối ăn), vi khuẩn Thiobacillus thioxidans có thể sinh trưởng ở pH = 0,5 trong khi vi khuẩn Thiobacillus denitrificans lại thích hợp phát triển ở pH = 10,7. Vi khuẩn Micro radiodurans có thể chịu được cường độ bức xạ tới 750.000 rad. Ở nơi sâu nhất trên đại dương (11.034m) nơi có áp lực tới 1103,4 atm vẫn thấy có VSV sinh sống. Nhiều VSV thích nghi với điều kiện sống hoàn toàn thiếu oxi (vi sinh vật yếm khí bắt buộc). Một số nấm sợi có thể phát triển thành váng ngay trong bể ngâm xác có nồng độ phenol rất cao. VSV rất dễ phát sinh biến dị bởi vì thường là đơn bào, đơn bội, sinh trưởng nhanh, số lượng nhiều, tiếp xúc trực tiếp với môi trường sống. Hình thức biến dị thường gặp là đột biến gen và dẫn đến những thay đổi về hình thái, cấu tạo, kiểu trao đổi chất, sản phẩm trao đổi chất, tính kháng nguyên, tính đề kháng, ... Chẳng hạn khi mới tìm ra khả năng sinh chất kháng sinh của nấm sợi Penicillium chrysogenum, người ta chiết xuất tới sản lượng 20 đơn vị penixilin trong 1 ml dịch lên men. Ngày nay, trong các nhà máy sản xuất penixilin, người ta đã đạt tới năng suất 100.000đơn vị/ml. Bên cạnh những biến dị có lợi, vi sinh vật cũng thường sinh ra những biến dị có hại đối với nhân loại, chẳng hạn biến dị về tính kháng thuốc. Năm 1946, tỉ lệ các chủng Staphylocin aureus kháng thuốc phân lập được ở bệnh viện là khoảng 14%, đến năm 1996 đã tăng lên đến trên 97%. Người ta chỉ tiêm cho bệnh nhân mỗi ngày khoảng 100.000 đơn vị penixilin, hiện nay có lúc phải tiêm đến 10.000.000 – 20.000.000 đơn vị. - Phân bố rộng, chủng loại nhiều. VSV phân bố ở khắp mọi nơi trên Trái đất. Chúng có mặt trong cơ thể người, động vật, thực vật, trong đất, trong nước, trong không khí, trên mọi đồ dùng, vật liệu, từ biển khơi đến núi cao, đến độ cao tới 84km trong không khí hay khoan sâu tới 427m dưới các lớp đá trầm tích người ta vẫn phát hiện được vi khuẩn sống. Về chủng loại, trong khi toàn bộ giới động vật có khoảng 1,5 triệu loài, thực vật khoảng 0,5 triệu loài thì VSV cũng có tới trên 100 ngàn loài, bao gồm 69 ngàn loài nấm; 23 ngàn loài vi tảo; 2,5 ngàn loài vi khuẩn lam; 1,5 ngàn loài vi khuẩn; 1,2 ngàn loài virus và ricketxi ...
- 47. 48 Nhà vi sinhhọc Nga nổi tiếng đã viết “VSV mà ta biết đến hiện nay nhiều lắm cũng không quá được 10% tổng số VSV có sẵn trong thiên nhiên”. Chẳng hạn về nấm, trung bình mỗi năm bổ sung thêm 1.500 loài mới. Trong quá trình hoạt động sống, bên cạnh những đặc tính có ích, VSV cũng gây nhiều tác hại cho người, động vật, thực vật như : làm biến đổi chất lượng thuốc, hỏng thực phẩm, một số có khả năng gây bệnh hoặc sinh độc tố có hại Để phục vụ cho việc kiểm nghiệm thực phẩm và thuốc bằng các thử nghiệm VSV ta cần tìm hiểu một số đặc điểm chính của 2 nhóm vi sinh vật là vi khuẩn và vi nấm 4.1.2. Vi khuẩn (Bacteria) 4.1.2.1. Đặc điểm Vi khuẩn là những VSV đơn bào có cấu tạo tế bào tiền nhân(Procaryote), có kích thước rất nhỏ. Đường kính tế bào phần lớn thay đổi trong khoảng 0,2 - 2 μm, chiều dài từ 2 - 8 μm. Vi khuẩn có nhiều hình dạng khác nhau, như hình cầu, hình que, xoắn, dấu phẩy. Vi khuẩn chỉ sinh sản vô tính, một số tạo bào tử. Mỗi tế bào vi khuẩn chỉ có một bào tử. Một số vi khuẩn có khả năng di động nhờ sự có mặt của một hoặc nhiều lông. 4.1.2.2. Phân loại Việc phân loại vi khuẩn rất phức tạp, phải dựa vào nhiều đặc điểm, hình thái, sinh lý, sinh hóa để chia vi khuẩn thành các họ, chi, loài khác nhau. Với mục đích phục vụ cho công tác kiểm nghiệm thuốc và thực phẩm, ta không đi sâu vào nghiên cứu phân loại, nhưng cần tìm hiểu vi khuẩn, theo các nhóm dựa trên hình thể, tính chất bắt màu thuốc nhuộm Gram và khả năng hô hấp của chúng. - Theo hình thể: + Cầu khuẩn (Coccus): Vi khuẩn hình cầu, có thể đứng riêng rẽ (Micrococcus), thành từng đám (Staphylococcus), hoặc chuỗi hay xếp thành từng đôi. + Trực khuẩn (Bacillus): Vi khuẩn hình que ngắn đứng riêng lẻ hay thành chuỗi hoặc hình que hai đầu tròn. + Xoắn khuẩn (Spirillum): Vi khuẩn hình lò xo như Treponema Pallidum. + Phẩy khuẩn (Vibrio): Vi khuẩn hình dấu phẩy như Vibrio Cholerae - Theo tính chất bắt màu thuốc nhuộm Gram. + Vi khuẩn có màu tím sau khi nhuộm Gram: Vi khuẩn Gram + + Vi khuẩn có màu đỏ sau khi nhuộm Gram: Vi khuẩn Gram -
- 48. 49 - Theo đặctính của quá trình hô hấp + Sử dụng oxy tự do trong quá trình hô hấp: Vi khuẩn hiếu khí + Phát triển cả trong điều kiện hiếu khí và kị khí, có quá trình hô hấp nitrat: Vi khuẩn kị khí không bắt buộc. + Chỉ sống trong điều kiện kị khí, có quá trình hô hấp Sulfat: Vi khuẩn kị khí bắt buộc. 4.1.2.3. Sinh sản của vi khuẩn Vi khuẩn sinh sản bằng cách phân đôi tế bào. Sự phân chia tế bào xảy ra rất nhanh. Trong điều kiện môi trường thích hợp và không có các yếu tố kìm hãm thì một tế bào vi khuẩn sau 6 giờ có thể sinh ra 250.000 tế bào mới. Tuy nhiên, sự nhân lên của vi khuẩn không phải là vô tận, nó còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố. trong môi trường nuôi cấy, sự sinh sản của vi khuẩn sau một thời gian nhất định sẽ ngừng lại vì nhiều nguyên nhân như: thực ăn bị hết dần hoặc vi khuẩn có thể tiết ra những chất kìm hãm sự phát triển của chúng. Tốc độ phát triển của vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy tĩnh thay đổi theo thời gian và tuân theo một quy luật nhất định bao gồm 4 pha: Pha lag, pha logarit, pha ổn định và pha tử vong. Sự phát triển của vi khuẩn trong môi trường lỏng có thể quan sát sau khoảng 18-24 giờ nuôi cấy. Chúng có thể làm đục môi trường, tạo váng trên bề mặt hoặc lắng cặn ở đáy ống nghiệm. Trên các môi trường đặc, khuẩn lạc của các vi khuẩn thường nhỏ hơn khuẩn lạc của vi nấm, bề mặt nhẵn, bóng, ướt hoặc nhăn nheo, ... Khuẩn lạc của vi khuẩn tạo sắc tố với các màu như: trắng (Staphylococcus albus), vàng (Staphylococcus aureus), hồng (Micrococcus), xanh (Pseudomonas aeruginosa), ... Mỗi vi khuẩn có đặc tính riêng về hình dạng, kích thước, màu sắc khuẩn lạc. Các đặc tính này giúp cho việc xác định vi khuẩn trong quá trình kiểm nghiệm dược phẩm. 4.1.3. Vi nấm (Microfungi) 4.1.3.1. Đặc điểm: Vi nấm có cấu tạo tế bào nhân thật (Eucaryote). Tế bào vi nấm rất nhỏ, muốn quan sát cần dùng kính hiển vi. Nấm không có chất diệp lục, sống hoại sinh hoặc ký sinh, sinh sản vô tính hoặc hữu tính. Vi nấm bao gồm hai loại là nấm men và nấm mốc. Trong kiểm nghiệm vi sinh vật, cần phát hiện hai loại này có trong dược phẩm, thực phẩm. 4.1.3.2. Nấm men (Yeast):
- 49. 50 Nấm men cócấu tạo đơn bào, sinh sản chủ yếu bằng nẩy chồi. Tế bào nấm men có kích thước, hình dạng khác nhau tùy loài. Chúng có thể hình cầu, bầu dục, hình quả chanh, hình ống, ... Khuẩn lạc nấm men bao gồm nhiều cá thể thường thuộc một loài phát triển từ một cá thể mẹ tạo thành một khối. Khuẩn lạc nấm men thường to hơn khuẩn lạc vi khuẩn, bề mặt có nếp nhăn hoặc trơn nhẵn, không tạo sợi. Nấm men thường được sử dụng nhiều trong công nghiệp thực phẩm như làm bánh mỳ, bia, rượu, ... Nhưng nhiều nấm men gây bệnh hoặc làm hỏng thực phẩm, thuốc. 4.1.3.3. Nấm mốc (Mold) Nấm mốc có cấu tạo sợi, sinh sản bằng bào tử, sống hoại sinh, chúng thường phát triển trên bề mặt cơ chất dưới dạng những lớp hình sợi, mạng nhện hoặc khối sợi bông. Sợi nấm rất nhỏ, đường kính trung bình 5μm, chiều dài có thể vài chục centimeters. Sợi nấm có vách ngăn hoăc không có vách ngăn. Toàn bộ sợi nấm và các nhánh phát triển từ một bào tử nấm rồi đan kết nhau thành một khối gọi là hệ sợi nấm. Trên môi trường thạch nuôi cấy, hệ sợi nấm phát triển thành một khối có tiết diện hình tròn hoặc gần tròn gọi là khuẩn lạc. Khuẩn lạc được đặc trưng bởi màu sắc của sợi nấm và của bào tử. Bề mặt khuẩn lạc có thể mượt, dạng hạt, dạng sợi hoặc xốp... Nấm sinh sản bằng bào tử: bào tử vô tính hoặc bào tử hữu tính. Sự sinh sản vô tính và hữu tính luôn đan kết nhau trong quá trình sinh trưởng của nấm. Vì vậy, nấm phát triển rất nhanh trên bề mặt các cơ chất. Nấm mốc thường gây nên những biến đổi về màu sắc, mùi vị, chất lượng của thuốc. Một số sinh các độc tố có hại cho người và động vật. 4.1.4. Sự ảnh hưởng của các yếu tố ngoại cảnh đối với quá trình phát triển của vi sinh vật Sinh trưởng và trao đổi chất của VSV liên quan chặt chẽ đến các điều kiện của môi trường bên ngoài. Các điều kiện này bao gồm hàng loạt các yếu tố khác nhau, tác động qua lại với nhau. Đa số các yếu tố đều có một đặc tính, tác dụng chung biểu hiện ở ba điểm hoạt động: tối thiểu, tối ưu, cực đại. Khi một yếu tố có tác dụng tối ưu, VSV phát triển với tốc độ cực đại. Nếu yếu tố này có tác dụng cực đại, VSV ngừng sinh trưởng và thường chết.
- 50. 51 Các yếu tốbên ngoài có ảnh hưởng đến đời sống của VSV là vật lý, hóa học và sinh học, trong đó, các yếu tố vật lý là đáng chú ý nhất. Yếu tố vật lý bao gồm nhiệt độ, độ ẩm và ánh sáng. 4.1.4.1. Nhiệt độ: Nhiệt đố là yếu tố quan trong nhất đối với đời sống VSV. Mỗi loài VSV có một giới hạn nhiệt độ phát triển thích hợp. Nói chung đối với VSV, nhiệt độ phát triển thường từ 15 - 450 C. Ở nhiệt độ cao sẽ làm thay đổi quá trình trao đổi chất của VSV, VSV bị chết. Các tế bào sinh dưỡng thường bị chết ở nhiệt độ 600 C trong khoảng 20 - 30phút. Các bào tử chỉ bị tiêu diệt ở nhiệt độ 1200 C trong khoảng 30 - 40phút. Tính chất này được ứng dụng trong việc tiệt trùng. Nhiệt độ thấp chỉ có tác dụng kìm hãm sự phát triển của VSV (trừ VSV ưa lạnh). 4.1.4.2. Độ ẩm: Hầu hết quá trình sống của VSV có liên quan đến nước. Khi thiếu nước xảy ra hiện tượng loại nước khỏi tế bào VSV, trao đổi chất bị giảm, tế bào sẽ chết. Vì vậy, để bảo quản thực phẩm, dược phẩm, dược liệu tránh khỏi tác động của VSV cần có một giới hạn độ ẩm nhất định. 4.1.4.3. Ánh sáng: Ánh sáng mặt trời gồm các tia bức xạ như: tử ngoại, hồng ngoại, gamma có tác dụng phá hủy tế bào VSV, đặc biệt là tia tử ngoại. Bức xạ UV bước sóng 260nm có tác dụng diệt khuẩn mạnh nhất. Dưới ảnh hưởng của UV, VSV bị chết hoặc đột biến tùy theo liều lượng. Để ngăn ngừa tác hại của VSV đối với thuốc, thực phẩm, các tác nhân vật lý trên cần được vận dụng trong quá trình sản xuất và bảo quản nhằm hạn chế tối đa số lượng VSV gây nhiễm ban đầu. Đồng thời các chế phẩm phải được quy định giới hạn VSV cho phép. 4.1.5. Môi trường nuôi cấy VSV Môi trường nuôi cấy là những chất dinh dưỡng thích hợp nhằm đảm bảo cho VSV sinh trưởng và phát triển. Môi trường cần có ba điều kiện sau: đầy đủ chất dinh dưỡng theo yêu cầu thí nghiệm, có pH trong khoảng quy định và phải vô trùng. Môi trường gồm ba loại:
- 51. 52 - Môi trườngtự nhiên: Nguyên liệu có nguồn gốc từ động vật hay thực vật (như cao thịt, cao men, tinh bột, ...). Thành phần có thể thay đổi tùy theo nguồn gốc nguyên liệu. - Môi trường tổng hợp: bao gồm các hóa chất thuần khiết đã được quy định và thường hòa tan trong nước. - Môi trường bán tổng hợp: trong thành phần môi trường có cả nguyên liệu tự nhiên và tổng hợp. Độ chính xác của kết quả thí nghiệm phụ thuộc rất nhiều vào chất lượng môi trường. 4.1.5.1. Phương pháp pha chế môi trường. Khi pha chế môi trường cần tiến hành qua 6 bước sau: - Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất: Dụng cụ pha chế môi trường tốt nhất là bằng men hoặc thủy tinh. Các dụng cụ phải rửa sạch hoặc tiệt trùng nóng trước khi sử dụng. Nguyên liệu pha chế môi trường phải đảm bảo chất lượng, hóa chất phải tinh khiết. - Cân đong nguyên liệu: Các nguyên liệu phải được cân đong chính xác, nhất là những hóa chất hoặc nguyên tố vi lượng có thể gây ức chế vi khuẩn (muối, mật, sắt,...) phải được cân bằng cân phân tích. - Hòa tan nguyên liệu: thường dùng nước cất hoặc nước khử khoáng để pha môi trường. Các hóa chất được hòa tan nóng, lạnh tùy theo tính chất của chúng. Môi trường không có thạch nên hòa tan lạnh hoặc nóng nhẹ. Môi trường có thạch cần đun cho thạch tan hoàn toàn sau đó mới cho các thành phần khác vào. - Điều chỉnh pH: Khi điều chỉnh pH của môi trường nên thực hiện ở nhiệt độ 45-500 C để pH ít bị thay đổi sau khi tiệt trùng. Các dung dịch NaOH 1N và HCl 1N thường được sử dụng để điều chỉnh pH. Sau khi điều chỉnh pH cần bổ sung nước cho đủ thể tích quy định. - Làm trong môi trường: Các môi trường lỏng (bao gồm các chất hòa tan) phải trong để dễ quan sát sự phát triển của VSV. Sau khi hòa tan các chất, nếu môi trường đục cần phải lọc vải gạc hoặc giấy. - Đóng ống tiệt trùng: Môi trường được cho vào ống nghiệm bình nón hoặc bình cầu, tùy theo yêu cầu thí nghiệm. Khi đóng ống, không được để môi trường dính vào miệng ống hoặc bình. Môi trường cần phải được tiệt trùng ngay sau khi đóng gói, nếu để lâu tạp khuẩn sẽ phát triển làm hỏng môi trường. Các môi trường thông thường được tiệt trùng ở 1100 C trong 30 phút hoặc 1200 C trong 20 phút.
- 52. 53 Môi trường củacác chất dễ bị phá hủy bởi nhiệt cần được tiệt trùng ở nhiệt độ thấp bằng phương pháp Tyndall, Pasteur, hoặc dùng lọc vi khuẩn. Môi trường được lấy ra khỏi nồi hấp ngay sau khi tiệt trùng xong. Nếu để lâu trong nồi hấp, môi trường bị đổi màu và giảm chất lượng. Người ta có thể pha chế môi trường bằng hỗn hợp bột môi trường có sẵn chứa đầy đủ các thành phần theo yêu cầu, chất lượng đảm bảo và ổn định. Khi làm thí nghiệm, môi trường được pha với nước theo tỷ lệ quy định nhưng phải dùng nước mới cất hoặc nước khử khoáng, trung tính để pha chế. 4.1.5.2. Bảo quản môi trường Môi trường bột khô được giữ ở nhiệt độ 10-120 C trong điều kiện khô, tránh ánh sáng. Môi trường đã pha chế được bảo quản ở 4-100 C trong 1-2 tháng tùy theo thành phần môi trường. 4.1.5.3. Các phương pháp tiệt trùng Tiệt trùng là một quá trình làm cho một vật hoặc một sản phẩm không còn VSV sống được. Tiệt trùng được thực hiện bằng phương pháp vật lý và hóa học. Chọn phương pháp tiệt trùng phụ thuộc vào tính chất lý hóa và độ bền vững của môi trường. - Tiệt trùng bằng nhiệt khô: Phương pháp này được sử dụng để tiệt trùng các dụng cụ thí nghiệm bền với nhiệt như bông băng, vải, gạc, dụng cụ thủy tinh. Điều kiện tiệt trùng là 1800 C/ 30phút hoặc 1700 C/ 1giờ hoặc 1600 C/ 2 giờ. Các dụng cụ thủy tinh để đóng môi trường phải được tiệt trùng khô trước khi dùng - Tiệt trùng bằng hơi nước: Phương pháp dùng nhiệt ướt thường được dùng để tiệt trùng môi trường nuôi cấy và các dụng cụ phẫu thuật. Môi trường thường được tiệt trùng bằng nồi hấp ở 1210 C/ 15phút. Các môi trường dễ bị hỏng bởi nhiệt như môi trường có đường, sữa, bia, máu, ... cần tiệt trùng ở nhiệt độ thấp bằng các phương pháp sau: Tiệt trùng gián đoạn (phương pháp Tyndall): Môi trường được hấp 3 - 4 lần ở nhiệt độ không quá 1000 C trong 30 - 40phút, cách nhau 24giờ. Giữa hai lần hấp cho môi trường vào ủ ở 28-320 C/ 24giờ cho bào tử nảy mầm. Các bào tử sống sót nảy mầm sẽ bị tiêu diệt ở lần hấp tiếp theo. Khử trùng nhiệt độ thấp (phương pháp Pasteur): Đun cách thủy môi trường 600 C/ 30phút hoặc 730 C/ 15phút sau đó làm lạnh đột ngột dưới 100 C. Phương pháp này không diệt được bào tử. - Phương pháp lọc: được dùng để tiệt trùng các chất dễ bị phá hủy bởi nhiệt. Cho chất lỏng chảy qua màng lọc có kích thước lỗ lọc ≤ 0,22μm. Phần chảy qua phễu
- 53. 54 được đựng trongcác dụng cụ vô trùng. Thiết bị lọc và màng lọc phải được tiệt trùng trước khi dùng. - Phương pháp dùng tia bức xạ: Tia tử ngoại được dùng nhiều nhất để tiệt trùng các buồng pha chế, tủ cấy VSV. Đèn tử ngoại phải được chiếu trực tiếp, thẳng góc với nơi làm thí nghiệm và liều lượng chiếu phải đủ với diện tích buồng. Tia UV ít có tác dụng diệt nấm, vì vậy khi khử trùng buồng pha chế cần phối hợp thêm phương pháp cùng hóa chất để khử nấm. 4.2. Xác định COLIFORMS Coliforms là một nhóm bao gồm một số vi khuẩn Gram âm không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc, có khả năng sinh hơi ở 370 C trong 24–48 giờ ở nhiệt độ nuôi cấy thích hợp. Vi khuẩn nhóm Coliforms bao gồm: E. Coli, Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella, Serratia. Coliforms được xem là nhóm VSV chỉ thị, số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác, biểu thị cho mức độ không đảm bảo của quả trình sản xuất và tình trạng vệ sinh sản xuất. Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng khi số Coliforms trong thực phẩm tăng cao thì khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác cũng cao. Coliforms chịu nhiêt (Coliforms ưa nhiệt, Coliforms phân) có khả năng lên men lactozơ sinh hơi trong khoảng 24 giờ ở nhiệt độ 440 C trong môi trường. Coliforms có khả năng sinh indol khi được ủ khoảng 24 giờ ở nhiệt độ 44,50 C trong canh trường Tryphon. Coliforms phân là một thành phần của hệ vi sinh đường ruột ở người và các động vật máu nóng khác. Xác đinh Coliforms và E.Coli cho biết mức độ ô nhiễm và tình trạng vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản, vận chuyển thực phẩm, nước uống cũng như chỉ thị sự ô nhiễm phân trong sản phẩm. 4.2.1. Phương pháp MPN 4.2.1.1. Nguyên tắc Mẫu được pha loãng ít nhất ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp nhau mỗi độ pha loãng được cấy trong 3 (hoặc 5) ống nghiệm lặp lại có chứa môi trường tăng sinh chọn lọc có ống Durham. Sau thời gian nuôi cấy, quan sát, theo dõi và sinh hơi và đổi màu để định tính sự hiện diện của từng ống nghiệm: đây là các ống dương tính. Ghi nhận các ống dương tính ở mỗi độ pha loãng và cấy tiếp sang môi trường khẳng định BGBL 2%. Từ các ống nghiệm có phản ứng dương tính, tra bảng Mac Grady để suy ra số lượng Coliforms hiện diện trong 1g (1ml) mẫu phân tích. 4.2.1.2. Dụng cụ, thiết bị - Dụng cụ chuẩn bị mẫu - Ống Durham - Ống nghiệm - Pipet - Tủ sấy - Cồn 700 - Tủ hấp - Tủ ấm
- 54. 55 - Tủ lạnh- Kéo, kẹp 4.2.1.3. Hóa chất, môi trường −Môi trường TLS (Trytose Lauryl Sulfat). −Môi trường canh thang lục sáng lactozơ mật bò 2% (Brilliant Green bile lactose Broth). −Môi trường lỏng đã được pha chế trước, cho vào ống nghiệm chứa ống Durham úp ngược. Sau khi khử trùng, chỉ sử dụng các ống nghiệm không có bọt khí bên trong ống Durham. 4.2.1.4. Tiến hành −Chuẩn bị dung dịch gốc và các dung dịch pha loãng. Pha loãng mẫu cho đến khi có nồng độ pha loãng 10-1 , 10-2 , 10-3 . −Gieo cấy: Cấy 1ml mẫu đã pha loãng ở nồng độ 10-1 , 10-2 , 10-3 vào các ống nghiệm có chứa môi trường TLS, mỗi độ pha loãng làm 3 ống nghiệm lặp lại. −Nuôi ủ: Đưa các ống đã cấy vào tủ ấm ở nhiệt độ 370 C 10 C trong thời gian 24 - 48 giờ. Quan sát và ghi nhận các ống có sinh khí và đục (kết quả dương tính). −Dùng que cấy vòng chuyển mẫu từ các ống nghiệm dương tính sang các ống nghiệm có chứa môi trường BGBL 2%. Để các ống đã cấy vào tủ ấm ở nhiệt độ 370 C 10 C trong thời gian 48 giờ. Với mỗi độ pha loãng, tính tổng số (kết quả dương tính). sinh khí và đục ((kết quả dương tính). 4.2.1.5. Kết quả Dựa vào số ống có kết quả dương tính của mỗi độ pha loãng, xác định số đặc trưng và sau đó là chỉ số MPN, từ đó tính được số Coliforms có trong 1g(1ml) mẫu phân tích. 4.2.2. Phương pháp đếm khuẩn lạc 4.2.2.1. Nguyên tắc Mẫu đã được đồng nhất hóa được cấy một lượng nhất định lên môi trường thạch chọn lọc thích hợp có chứa lactozơ. Trên môi trường Endo có chứa natri sulfit và fucshin, có khả năng ức chế các vi khuẩn gram (+). Trong quá trình phát triển trên môi trường này, Coliforms lên men đường lactozơ tạo thành aldehyt và acid, aldehyt tác động đến phức chất fucshin- sulfit và giải phóng fucshin. Fucshin nhuộm các khuẩn lạc từ màu hồng đến màu đỏ cánh sen, tròn, bờ đều, có thể có ánh kim hoặc không. 4.2.2.2. Dụng cụ và thiết bị - Đĩa petri - Dụng cụ đồng nhất mẫu - Ống nghiệm - Pipet - Tủ sấy - Cồn 700 - Tủ hấp - Tủ ấm - Tủ lạnh - Kéo, kẹp 4.2.2.3. Hóa chất, môi trường - Môi trường thạch lactose lục đỏ sáng mật bò (Vilolet Bile Lactose Red Agar) - Môi trường EMB
- 55. 56 - Môi trườngEndo - Môi trường Istrati Tất cả dụng cụ đã được khử trùng trước khi tiến hành thử nghiệm. Môi trường đã được pha chế trước, cho vào các đĩa petri, làm khô bề mặt trong điều kiện vô trùng và được bảo quản trong tủ lạnh, tránh ánh sáng trước khi sử dụng. 4.2.2.4. Tiến hành −Chuẩn bị dung dịch gốc và các dung dịch pha loãng. Pha loãng mẫu cho đến khi có nồng độ pha loãng 10-1 , 10-2 , 10-3 . −Gieo cấy: Cấy 1ml giọt mẫu đã pha loãng ở các nồng độ vào các đĩa có chứa môi trường thạch Endo, mỗi độ pha loãng làm 3 đĩa lặp lại. Tráng đều mẫu trên mặt thạch. −Nuôi ủ: Đưa các ống đã cấy vào tủ ấm ở nhiệt độ 370 C 10 C trong thời gian 48 – 72 giờ. −Quan sát và ghi nhận các đĩa petri đã nuôi có các khuẩn lạc có màu hồng đến màu đỏ cánh sen, tròn, bờ đều, có thể có ánh kim. 4.2.2.5. Kết quả Đếm các khuẩn lạc có màu hồng đến màu đỏ trong các đĩa có khoảng 15 – 150 khuẩn lạc. Số lượng Coliforms có trong 1ml (1g) mẫu được tính theo công thức: ) g / CFU , ml / CFU ( v . f ). n 1 , 0 n ( C N 1 2 1 + Σ = Trong đó: ΣC: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất các các đĩa n1 : Số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ 1 (độ pha loãng thấp nhất) n2 : Số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ 2 (độ pha loãng tiếp theo) f1 : hệ số pha loãng của đĩa đếm thứ 1 v : Thể tích mẫu cấy của mỗi đĩa petri Nếu ngay ở đĩa cấy mẫu nguyên chất lỏng hoặc dung dịch gốc mà có số lượng ít hơn 30 khuẩn lạc thì vẫn lấy kết quả đó. Nếu sử dụng các môi trường khác thì khuẩn lạc: - Có màu đỏ sẫm trên môi trường VBLR - Có màu xanh ánh kim trên môi trường EMB - Có màu vàng trên môi trường Istrati 4.3. Xác định ESCHERICHIA COLI E. Coli thuộc nhóm Coliforms phân, rất bền với phenol 0,085% và sinh indol ở nhệt độ 42 – 440 C. E. Coli thường biểu thị độ nhiễm phân tương đối mới. Cũng giống như Coliforms, xác định E. Coli có thể nuôi cấy trên môi trường lỏng (phương pháp MPN) hoặc trên môi trường rắn chọn lọc, sau đó thực hiện thêm một số phép thử khẳng định. 4.3.1. Phương pháp MPN 4.3.1.1. Nguyên tắc
- 56. 57 Mẫu được phaloãng ít nhất ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp nhau mỗi độ pha loãng được cấy trong 3 (hoặc 5) ống nghiệm lặp lại có chứa môi trường tăng sinh chọn lọc TLS. Sau thời gian nuôi cấy, quan sát và ghi nhận các ống dương tính và cấy tiếp sang môi trường EC. Sau khi đã nuôi cấy ở nhiệt độ 440 C thì theo dõi, kiểm tra có sinh Indol không. Đếm số ống nghiệm nuôi cấy trên môi trường EC dương tính ứng với các ống có sinh Indol, tra bảng Mac Grady để suy ra số lượng E. Coli hiện diện trong mẫu phân tích. 4.3.1.2. Dụng cụ, thiết bị - Dụng cụ chuẩn bị mẫu - Ống Durham - Ống nghiệm - Pipet - Tủ sấy - Cồn 700 - Tủ hấp - Tủ ấm - Tủ lạnh - Kéo, kẹp 4.3.1.3. Hóa chất, môi trường - Môi trường TLS (Trytose Lauryl Sulfat). - Môi trường EC. - Môi trường canh thang lục sáng lactozơ mật bò 2% (Brilliant Green bile lactose Broth). - Môi trường lỏng đã được pha chế trước, cho vào ống nghiệm chứa ống Durham úp ngược. Sau khi khử trùng, chỉ sử dụng các ống nghiệm không có bọt khí bên trong ống Durham. - Dung dịch Trypon (pepton). - Thuốc thử Indol. 4.3.1.4. Tiến hành - Chuẩn bị dung dịch gốc và các dung dịch pha loãng. Pha loãng mẫu cho đến khi có nồng độ pha loãng 10-1 , 10-2 , 10-3 . - Gieo cấy: Cấy 1ml mẫu đã pha loãng ở nồng độ 10-1 , 10-2 , 10-3 vào các ống nghiệm có chứa môi trường TLS, mỗi độ pha loãng làm 3 ống nghiệm lặp lại. - Nuôi ủ: Đưa các ống đã cấy vào tủ ấm ở nhiệt độ 370 C 10 C trong thời gian 24 – 48 giờ. Quan sát và ghi nhận các ống có sinh khí và đục (kết quả dương tính). - Dùng que cấy vòng chuyển mẫu từ các ống nghiệm dương tính sang các ống nghiệm có chứa môi trường EC. Để các ống đã cấy vào tủ ấm ở nhiệt độ 370 C 10 C trong thời gian 48 giờ. Với mỗi độ pha loãng, tính tổng số (kết quả dương tính). sinh khí và đục ((kết quả dương tính). Phép thử khẳng định: - Kiểm tra hình thái: Nhuộm gram, soi kính để xác định Gram (-), trực khuẩn nhỏ dài. Từ ống canh trường ria sang môi trường Endo hoặc EMB đặt trong tủ ấm ở 370 C trong 24 giờ. Nếu phát hiện thấy những khuẩn lạc đỏ ánh kim (hay không có ánh kim), cấy tiếp sang môi
- 57. 58 trường thạch thườngđể thực hiện phản ứng IMVIC (các phản ứng này thực hiện độc lập nhưng đồng thời). Phản ứng IMVIC * Phản ứng sinh indol: - Dùng que cấy vòng chuyển mẫu từ các ống nghiệm có chứa môi trường EC dương tính sang các ống nghiệm có chứa Trypton. Để các ống đã cấy vào tủ ấm ở nhiệt độ 440 C ± 10 C trong thời gian 48 giờ. - Thêm 0,5ml thuốc thử Indol vào các ống nghiệm có chứa Trypton để nuôi cấy, lắc đều và sau 1 phút thì quan sát và ghi nhận số lượng các ống có màu đỏ (kết quả dương tính chứng tỏ có Indol) cho mỗi độ pha loãng. * Phản ứng MR: Cấy chuyền vi khuẩn nghi ngờ từ thạch đường vào môi trường Clark Lubs. Nuôi tủ ấm 370 C trong thời gian từ 48 – 96 giờ. Sau đó hút 5ml canh khuẩn đó cho vào một ống nghiệm khác để dùng cho phản ứng VP. Môi trường Clark Lubs còn lại cho 5 giọt metyl đỏ 0,2% vào. Phản ứng dương khi môi trường có màu đỏ ngay sau khi cho thuốc thử vào. * Phản ứng VP: Phương pháp 1: Cho 5ml dung dịch amonium sulfat đồng vào môi trường Clark Lubs ở phần trên. Quan sát phản ứng: phản ứng dương khi xuất hiện màu đỏ trong vòng 15-20 phút sau khi cho thuốc thử vào. Phương pháp 2: Cho 3ml dung dịch naphtol 5% và 1ml dung dịch KOH 40% vào môi trường Clark Lubs ở phần trên. Quan sát phản ứng: phản ứng dương khi xuất hiện màu đỏ trong vòng 15-20 phút sau khi cho thuốc thử vào. * Phản ứng citrate: Cấy chuyền vi khuẩn nghi ngờ từ thạch thường vào môi trường Simmons Citrate. Nuôi tủ ấm 370 C trong thời gian 24 giờ. Phản ứng dương khi môi trường đỏ chuyển sang xanh. 4.3.1.5. Kết quả Với mức độ pha loãng, đếm số lượng ống nghiệm có màu đỏ (Indol dương tính), xác định chỉ số MPN, từ đó tính được số E. Coli có trong 1g(1ml) mẫu phân tích. 4.3.2. Phương pháp đếm khuẩn lạc 4.3.2.1. Nguyên tắc Mẫu đã được đồng nhất hóa được cấy một lượng nhất định lên môi trường thạch chọn lọc thích hợp có chứa lactozơ. Trên môi trường Endo có chứa natri sulfit và fucshin, có khả năng ức chế các vi khuẩn gram (+). Trong quá trình phát triển trên môi trường này, Coliforms lên men đường lactozơ tạo thành aldehyt và acid, aldehyt tác động đến phức chất fucshin- sulfit và giải phóng fucshin. Fucshin nhuộm các khuẩn lạc từ màu hồng đến màu đỏ cánh sen, tròn, bờ đều, có thể có ánh kim hoặc không. Nếu khuẩn lạc màu hồng có ánh kim có thể giả định là E. Coli thì kiểm tra có sinh Indol hay không. 4.3.2.2. Dụng cụ và thiết bị
- 58. 59 - Đĩa petri- Dụng cụ đồng nhất mẫu - Ống nghiệm - Pipet - Tủ sấy - Cồn 700 - Tủ hấp - Tủ ấm - Tủ lạnh - Kéo, kẹp 4.3.2.3. Hóa chất, môi trường - Môi trường thạch lactose lục đỏ sáng mật bò (Vilolet Bile Lactose Red Agar) - Môi trường EMB - Môi trường Endo - Môi trường Istrati - Thuốc thử Indol - Dung dịch Trypon (pepton) Tất cả dụng cụ đã được khử trùng trước khi tiến hành thử nghiệm. Môi trường đã được pha chế trước, cho vào các đĩa petri, làm khô bề mặt trong điều kiện vô trùng và được bảo quản trong tủ lạnh, tránh ánh sáng trước khi sử dụng. 4.3.2.4. Tiến hành − − − − Chuẩn bị dung dịch gốc và các dung dịch pha loãng. Pha loãng mẫu cho đến khi có nồng độ pha loãng 10-1 , 10-2 , 10-3 . − − − − Gieo cấy: Cấy 1ml giọt mẫu đã pha loãng ở các nồng độ vào các đĩa có chứa môi trường thạch Endo, mỗi độ pha loãng làm 3 đĩa lặp lại. Tráng đều mẫu trên mặt thạch. − − − − Nuôi ủ: Đưa các ống đã cấy vào tử ấm ở nhiệt độ 370 C 10 C trong thời gian 48 – 72 giờ. − − − − Quan sát và ghi nhận các đĩa petri đã nuôi có các khuẩn lạc có màu hồng đến màu đỏ cánh sen, tròn, bờ đều, có thể có ánh kim để tiến hành khẳng định đó là E. Coli. Phép thử khẳng định: Kiểm tra hình thái: Nhuộm gram, soi kính để xác định Gram (-), trực khuẩn nhỏ dài. Từ ống canh trường ria sang môi trường Endo hoặc EMB đặt trong tủ ấm ở 370 C trong 24 giờ. Nếu phát hiện thấy những khuẩn lạc đỏ ánh kim (hay không có ánh kim), cấy tiếp sang môi trường thạch thường để thực hiện phản ứng IMVIC (các phản ứng này thực hiện độc lập nhưng đồng thời). Phản ứng IMVIC * Phản ứng sinh indol: - Dùng que cấy vòng chuyển mẫu từ các ống nghiệm có chứa môi trường EC dương tính sang các ống nghiệm có chứa Trypton. Để các ống đã cấy vào tủ ấm ở nhiệt độ 440 C ± 10 C trong thời gian 48 giờ. - Thêm 0,5ml thuốc thử Indol vào các ống nghiệm có chứa Trypton để nuôi cấy, lắc đều và sau 1 phút thì quan sát và ghi nhận số lượng các ống có màu đỏ (kết quả dương tính chứng tỏ có Indol) cho mỗi độ pha loãng.
- 59. 60 * Phản ứngMR: Cấy chuyền vi khuẩn nghi ngờ từ thạch đường vào môi trường Clark Lubs. Nuôi tủ ấm 370 C trong thời gian từ 48 – 96 giờ. Sau đó hút 5ml môi trường đó cho vào một ống nghiệm khác để dùng cho phản ứng VP. Môi trường Clark Lubs còn lại cho 5 giọt metyl đỏ 0,2% vào. Phản ứng dương khi môi trường có màu đỏ ngay sau khi cho thuốc thử vào. * Phản ứng VP: Phương pháp 1: Cho 5ml dung dịch amonium sulfat đồng vào môi trường Clark Lubs ở phần trên. Quan sát phản ứng: phản ứng dương khi xuất hiện màu đỏ trong vòng 15-20 phút sau khi cho thuốc thử vào. Phương pháp 2: Cho 3ml dung dịch naphtol 5% và 1ml dung dịch KOH 40% vào môi trường Clark Lubs ở phần trên. Quan sát phản ứng: phản ứng dương khi xuất hiện màu đỏ trong vòng 15-20 phút sau khi cho thuốc thử vào. * Phản ứng citrate: Cấy chuyền vi khuẩn nghi ngờ từ thạch thường vào môi trường Simmons Citrate. Nuôi tủ ấm 370 C trong thời gian 24 giờ. Phản ứng dương khi môi trường đỏ chuyển sang xanh. 4.3.2.5. Kết quả Dựa vào số khuẩn lạc nghi ngờ là E.Coli đã đếm được trên các đĩa, tổng số ống nghiệm thử Indol dương tính (có màu đỏ) và tổng số ống thử Indol để tính toán kết quả. Số lượng E.Coli có trong 1ml (1g) mẫu được tính theo công thức: ) g / CFU , ml / CFU ( R . v . f ). n 1 , 0 n ( C N 1 2 1 + Σ = Trong đó: ΣC : Tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất các các đĩa n1 : Số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ 1 (độ pha loãng thấp nhất) n2 : Số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ 2 (độ pha loãng tiếp theo) f1 : hệ số pha loãng của đĩa đếm thứ 1 v : Thể tích mẫu cấy của mỗi đĩa petri R : Số ống thử Indol dương tính (có màu đỏ)/tổng số ống thử Indol. Xác định E. Coli gây bệnh khi phát hiện trực khuẩn Gram (-) với các đặc tính sinh hóa như sau: Indol MR VB Citrate E.Coli loại I + + - - E.Coli loại II - + - - 4.4. Xác định STAPHYLOCOCCUS AUREUS Staphylococcus aureus là vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy ý, hình cầu, gram dương, có khả năng tạo ra nội độc tố gây ngộ độc thực phẩm. Staphylococcus aureus
- 60. 61 có khả nănglên men và sinh acid từ maniton, trehalose, saccarozơ, có khả năng tăng cường trong môi trường chứa đến 15%NaCl. Hầu hết đều tạo sắc tố màu vàng sau 1-2 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng. Staphylococcus aureus có thể nhiễm vào thực phẩm qua con đường tiếp xúc với người đang thao tác trong quá trình chế biến thực phẩm. Sự hiện diện với mức độ cao của Staphylococcus aureus trong thực phẩm biểu hiện điều kiện vệ sinh và kiểm soát nhiệt độ kém của quá trình chế biến. 4.4.1. Nguyên tắc Dựa vào tính chất đặc biệt của Staphylococcus aureus là phát triển được trên môi trường muối manitol cũng như trên môi trường Chapman tạo khuẩn lạc màu vàng hoặc trên môi trường Baird-Paker tạo khuẩn lạc màu đen. Nếu sau khi nuôi cấy, không có khuẩn lạc mọc trên các môi trường thạch chọn lọc nói trên thì cũng chưa thể khẳng định là không có Staphylococcus aureus trong mẫu phân tích vì vi khuẩn này ở lượng rất nhỏ. Trong trường hợp này nên tăng lượng vi khuẩn này bằng cách nuôi cấy trên môi trường Chapman lỏng, sau đó mới nuôi cấy trên môi trường thạch Chapman chọn lọc. Như vậy ta có thể xác định được số lượng ít nhất của Staphylococcus aureus trong thể tích sản phẩm ban đầu. 4.4.2. Dụng cụ, thiết bị - Dụng cụ chuẩn bị mẫu - Đĩa petri - Ống nghiệm - Pipet 2,5,10, 50ml - Tủ sấy - Cồn 700 - Tủ hấp - Tủ ấm - Tủ lạnh - Kéo, kẹp - Cân kỹ thuật 4.4.3. Hóa chất, môi trường - Môi trường Chapman lỏng (cực mặn) - Môi trường Chapman - Môi trường Baird-Paker - Môi trường đã được pha chế trước, cho vào ống nghiệm (15ml/ống). Sau khi khử trùng, bảo quản trong tủ lạnh nếu chưa sử dụng ngay. 4.4.4. Tiến hành - Chuẩn bị mẫu thử để tạo thành một thể đồng nhất và pha loãng mẫu nếu thấy cần thiết. Trong trường hợp dự đoán là lượng vi khuẩn Staphylococcus aureus ít thì có thể nuôi cấy tăng sinh như sau: lấy 1ml mẫu nguyên chất hay dung dịch huyền phù (nếu mẫu ở dạng rắn) cho vào ống nghiệm có chứa 9ml môi trường Chapman lỏng và nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 370 C trong thời gian 24giờ. Nếu có sự phát triển của vi sinh vật (môi trường bị đục) thì tiếp tục các thí nghiệm tiếp theo. - Cho 0,05ml hoặc 1 giọt mẫu đã pha loãng hay mẫu đã qua nuôi cấy tăng sinh và cấy lên bề mặt môi trường thạch Chapman, hoặc Baird-Paker và tráng đều (nên làm đồng thời ít nhất 2 ống nghiệm một lúc cho mỗi nồng độ pha loãng). - Nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 370 C trong thời gian 24 – 72 giờ.
- 61. 62 - Quan sátkhuẩn lạc mọc trên đĩa. Trên môi trường thạch Chapman, đếm các khuẩn lạc tròn, màu vàng (1-2mm). Trên môi trường Baird-Paker, đếm các khuẩn lạc có màu đen bóng, một mép viền màu trắng xám, xung quanh khuẩn lạc có một vùng sáng trong, rộng (trong khi đó bề mặt môi trường đục). - Nếu kiểm tra các khuẩn lạc dưới kính hiển vi là vi khuẩn Gram (+), tạo thành từng chùm như các chùm nho thì nghi ngờ có thể là Môi trường Baird-Paker và nên làm phản ứng sinh hóa coagulase để khẳng định. Phép thử khẳng định: Đây là phản ứng rất quan trọng để xác định Staphylococcus aureus. Cho vào ống nghiệm cỡ nhỏ (7mm) 0,5ml huyết tương thỏ, dung que cấy vòng chuyển vi khuẩn từ những khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường phân lập. Lắc đều cho 2 môi trường trộn đều, để ở 370 C, tiếp tục kiểm tra mẫu sau mỗi 2 giờ. Mọi sự ngưng kết tạo thành một thể đông trong ống nghiệm gọi là dương tính. Nếu sau 4 giờ vẫn âm tính cần để 370 C trong thời gian 24 giờ để phát hiện những chủng tạo men glucozơ yếu. Tiếp tục nuôi cấy đến 24 giờ thì ngừng nếu không thấy xuất hiện khối kết tụ. Nên thực hiện thêm 2 thí nghiệm khác để đối chứng như sau: - Một ống đối chứng âm tính không có vi khuẩn mà chỉ cấy huyết tương thỏ và vài giọt nước cất tiệt trùng. - Một ống đối chứng đã cấy sẵn tụ cầu gây bệnh. 4.4.5. Kết quả Căn cứ vào những đặc tính sau để kết luận mẫu có nhiễm Staphylococcus aureus là: - Sắp xếp thành chùm nho điển hình - Lên men đường manitol - Đông huyết tương Dựa vào số khuẩn lạc nghi ngờ là Staphylococcus aureus đã đếm được trên các đĩa, và dựa vào tỷ lệ số ống thử phản ứng coagulase dương tính trên tổng số ống thử để tính toán kết số lượng Staphylococcus aureus trung bình có trong 1ml (1g) mẫu được tính theo công thức: ) g / CFU , ml / CFU ( R . v . f ). n 1 , 0 n ( C N 1 2 1 + Σ = Trong đó: ΣC : Tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất các các đĩa n : Số đĩa đã nuôi cấy f : hệ số pha loãng của mẫu v : Thể tích mẫu cấy của mỗi đĩa petri R : Số ống thử phản ứng coagulase dương tính (có màu đỏ)/tổng số ống thử. 4.5. Xác định tổng số VI KHUẨN KỊ KHÍ SINH H2S 4.5.1. Môi trường, hóa chất - Môi trường thạch Wilson Blair
- 62. 63 - Dung dịchNatri sulfit (Na2SO3) - Dung dịch phèn sắt (FeSO4.7H2O) 5% 4.5.2. Tiến hành - Pha loãng mẫu: Tùy theo mức độ nhiễm bẩn của mẫu (ví dụ nước mắm) mà pha loãng mẫu cho đến khi có nồng độ pha loãng 10-1 , 10-2 , 10-3 . - Gieo cấy: Cho 1 ml dung dịch mẫu vào ống có chứa sẵn 2ml dung dịch natri sulfit 20% và 5 giọt phèn sắt 5%. Sau đó đổ thạch Wilson Blair đã đun chảy và làm nguội đến 45-500 C vào khoảng 2/3 ống nghiệm. Cho một giọt parafin lỏng trên mặt thạch ống nghiệm đã cấy mẫu. - Đun cách thủy ở 750 C trong 5 phút. Làm đông ngay bằng cách để vào tủ lạnh hay ngâm vào nước lạnh. Để 370 C trong 24 – 48 giờ, nếu môi trường đục được xem là dương tính. Các khuẩn lạc Clostridium Welchi trên môi trường này có màu đen, tròn đều. 4.5.3. Kết quả Tất cả các khuẩn lạc đen, to, nhỏ mọc trong ống nghiệm đều là vi khuẩn kị khí sinh H2S. 4.6. Xác định tổng số VI KHUẨN HIẾU KHÍ SINH H2S 4.6.1. Môi trường, hóa chất - Môi trường nước pepton - Giấy có tẩm acetat chì 4.6.2. Tiến hành - Pha loãng mẫu: Tùy theo mức độ nhiễm bẩn của mẫu (ví dụ nước mắm) mà pha loãng mẫu cho đến khi có nồng độ pha loãng 10-1 , 10-2 , 10-3 . - Gieo cấy: Dùng 2 ống nước pepton có cho thêm 2ml Na2SO3 đặc: + 1 ống cấy 10ml mẫu chưa pha loãng + 1 ống cấy 1ml mẫu pha loãng 10-1 , 10-2 , 10-3 Dùng 2 ống nước pepton khác có cho thêm 2ml Na2SO3 25% + 1 ống cấy 10ml mẫu chưa pha loãng + 1 ống cấy 1ml mẫu pha loãng 10-1 , 10-2 , 10-3 Trên mỗi ống đều treo một mảnh giấy tẩm chì acetat. Chì acetat có độc tính đối với vi khuẩn, vì vậy không nên để giấy chạm vào dung dịch muối. Để ở 370 C trong 24 – 48 giờ, nếu có vi khuẩn hiếu khí sinh H2S thì giấy tẩm chì acetat sẽ có màu đen. 4.6.3. Kết quả Ở ống môi trường nuôi cấy mẫu chưa pha loãng, nếu giấy tẩm chì acetat có màu đen thì ước lượng có 10000 vi khuẩn hiếu khí H2S. Ở ống môi trường nuôi cấy mẫu pha loãng 10-1 , 10-2 , 10-3 , nếu giấy tẩm chì acetat có màu đen thì đem kết quả ước lượng trên nhân với 10 hoặc 100.
- 63. 64 4.7. Xác địnhtrực khuẩn SALMONELLA Salmonella là loại trực khuẩn, gram(-), yếm khí tùy tiện, dài 2-3μm, không sinh bào tử, lên men glucozơ và manitol sinh axit nhưng không lên men saccarozơ và lactozơ, không sinh Indol, không phân giải ure, sinh H2S. Salmonella có nhiều trong các loại thịt tươi sống, cá, trứng, sữa, các loại thức ăn cho gia súc. 4.7.1. Nguyên tắc Số lượng Salmonella rất ít trong thực phẩm, do đó có thể làm tăng số lượng có trong mẫu bằng cách nuôi cấy trong mẫu bằng cách nuôi cấy trong môi trường tăng sinh, ở nhiệt độ thích hợp (430 C). Sau đó nuôi cấy trong môi trường chọn lọc đặc hiệu để nhận biết các khuẩn lạc nghi ngờ là Salmonella. Để có kết luận chắc chắn thì sử dụng các phép thử kiểm tra đặc tính sinh hóa của khuẩn lạc nghi ngờ nói trên. 4.7.2. Dụng cụ - Dụng cụ chuẩn bị mẫu - Đĩa petri - Ống nghiệm - Pipet 2, 5, 10, 50ml - Tủ sấy - Cồn 700 - Tủ hấp - Tủ ấm - Tủ lạnh - Kéo, kẹp - Cân kỹ thuật 4.7.3. Môi trường, hóa chất - Dung dịch đệm pepton - Môi trường Selenite Broth hoặc Tetrathionate Brilliant Green - Môi trường SS Agar hoặc Mac Conkey hoặc Brismuth Sulfite Agar - Môi trường KIA (Kligller Iron Agar) hoặc TSI (Triple Sugar Iron Agar) - Môi trường MIU (Metility Indol Urea) - Môi trường Muller Kauffman Môi trường đã được pha chế trước, cho vào ống nghiệm (15ml/ống). Sau khi khử trùng, bảo quản trong tủ lạnh nếu chưa sử dụng ngay. 4.7.4. Tiến hành Nuôi cấy tăng sinh: - Cân 25g mẫu (nếu là sản phẩm đặc) hoặc 10ml mẫu (nếu là sản phẩm lỏng) vào môi trường tăng sinh, lắc đều, để yên 370 C trong 24 giờ. - Sau 24 giờ, Salmonella làm đục môi trường tăng sinh, có thể có cặn và tạo váng mỏng, làm biến màu môi trường Muller Kauffman từ xanh lục sang vàng. Phân lập: - Cấy ria canh trường từ những ống tăng sinh nghi ngờ lên đĩa petri chứa môi trường phân lập. Cần cấy thưa nhằm tạo những khuẩn lạc riêng biệt, để yên 370 C trong 24 giờ. Hình 4.1. Cấy Samonella
- 64. 65 - Trên cácmôi trường phân lập Salmonella tạo những khuẩn lạc tròn, hơi lồi, trong bóng, đường kính 2-4mm (đôi khi có tâm đen). - Nhuộm gram các khuẩn lạc nghi ngờ, những mẫu có trực trùng Gram (-) được kiểm tra tiếp. Phản ứng sinh hóa: - Cấy đâm sâu rồi cấy ria vi khuẩn từ những khuẩn lạc nghi ngờ lên ống thạch nghiêng TSI hoặc KIA, và cấy đâm sâu vào môi trường MIU, để yên 370 C trong 24 giờ. Trên môi trường TSI hoặc KIA, Salmonella: - Tạo những khuẩn lạc màu đen: H2S (+) - Giữ nguyên mẫu đỏ của phần nguyên: lactozơ (-), saccarozơ (-) - Làm phần đáy đổi màu từ đỏ sang vàng: glucozơ (+) - Tạo những khoảng khí trong nền thạch: có sinh hơi. Trên môi trường MIU, Salmonella: - Mọc lan ra khỏi đường cấy thẳng: có tính di động. - Không làm biến màu môi trường: urea (-). Cho lên bề mặt môi trường MIU khoảng 0,5ml thuốc thử Kovacs, Salmonella: - Không làm đỏ thuốc thử: Indol (-) 4.7.5. Kết quả Xác định có Salmonella khi mẫu chứa vi khuẩn làm đục môi trường tăng sinh tạo khuẩn lạc trên mô phân lập, có dạng trực khuẩn gram (+), có tính di động và có các phản ứng sinh hóa H2S (+), lactozơ (-), saccarozơ (-), glucozơ (+),urea (-), indol (-). 4.8. Xác định SHIGELLA Shigella 4.8.1. Nguyên tắc Giống như phần xác định Salmonella. 4.8.2. Dụng cụ - Dụng cụ chuẩn bị mẫu - Đĩa petri - Ống nghiệm - Pipet 2, 5, 10, 50ml - Tủ sấy - Cồn 700 - Tủ hấp - Tủ ấm - Tủ lạnh - Kéo, kẹp - Cân kỹ thuật 4.8.3. Môi trường, hóa chất - Dung dịch đệm pepton - Môi trường Selenite Broth hoặc Tetrathionate Brilliant Green - Môi trường SS Agar hoặc Mac Conkey hoặc Brismuth Sulfite Agar - Môi trường KIA (Kligller Iron Agar) hoặc TSI (Triple Sugar Iron Agar) - Môi trường MIU (Metility Indol Urea) - Môi trường Muller Kauffman
- 65. 66 Môi trường đãđược pha chế trước, cho vào ống nghiệm (15ml/ống). Sau khi khử trùng, bảo quản trong tủ lạnh nếu chưa sử dụng ngay. 4.8.4. Tiến hành Nuôi cấy tăng sinh: - Cân 25g mẫu (nếu là sản phẩm đặc) hoặc 10ml mẫu (nếu là sản phẩm lỏng) vào môi trường tăng sinh, lắc đều, để yên 370 C trong 24 giờ. - Sau 24 giờ, Shigella làm đục môi trường tăng sinh, có thể có cặn và tạo váng mỏng, làm biến màu môi trường Muller Kauffman từ xanh lục sang vàng. Phân lập: - Cấy ria canh trường từ những ống tăng sinh nghi ngờ lên đĩa petri chứa môi trường phân lập. Cần cấy thưa nhằm tạo những khuẩn lạc riêng biệt, để yên 370 C trong 24 giờ. - Trên các môi trường phân lập Shigella tạo những khuẩn lạc tròn, hơi lồi, mờ, đường kính 1-2mm không bao giờ có tâm đen. - Nhuộm gram các khuẩn lạc nghi ngờ, những mẫu có trực trùng Gram (-) được kiểm tra tiếp. Phản ứng sinh hóa: - Cấy đâm sâu rồi cấy ria vi khuẩn từ những khuẩn lạc nghi ngờ lên ống thạch nghiêng TSI hoặc KIA, và cấy đâm sâu vào môi trường MIU, để yên 370 C trong 24 giờ. Trên môi trường TSI hoặc KIA, Shigella: - Không tạo những khuẩn lạc màu đen: H2S (-) - Giữ nguyên mẫu đỏ của phần nguyên: lactozơ (-), saccarozơ (-) - Làm phần đáy đổi màu từ đỏ sang vàng: glucozơ (+) - Tạo những khoảng khí trong nền thạch: không có sinh hơi. Trên môi trường MIU, Shigella: - Không làm biến màu môi trường: urea (-). Cho lên bề mặt môi trường MIU khoảng 0,5ml thuốc thử Kovacs, Shigella: - Không làm đỏ thuốc thử: Indol (-). Trên môi trường MIU, Shigella cho những kết quả giống như Salmonella với điểm khác biệt là Shigella không mọc lan ra khỏi đường cấy thẳng, không có tính di động. 4.8.5. Kết quả Xác định có Shigella khi mẫu chứa vi khuẩn làm đục môi trường tăng sinh tạo
- 66. 67 khuẩn lạc điểnhình trên môi trường phân lập, có dạng trực khuẩn gram (-), không có tính di động và có các phản ứng sinh hóa H2S (-), lactozơ (-), saccarozơ (-), glucozơ (+), urea (-), indol (-).
- 67.
- 68.
- 69.
- 70. 71 PHẦN II PHÂN TÍCHCHUYÊN ĐỀ CHƯƠNG 5 PHÂN TÍCH CHẤT ĐỘC TRONG THỰC PHẨM Các hợp chất gây độc với cơ thể người trong thực phẩm thuờng là: các kim loại nặng như đồng, chì, kẽm, thiếc…, các hợp chất chứa arsen, flo…, các độc tố do vi sinh vật gây ra như độc tố Aflatoxin…, thuốc trừ sâu, phẩm màu… 5.1. Các phương pháp xác định Cu, Zn, Pb và Cd 5.1.1. Phương pháp xác định đồng 5.1.1.1 Xác định đồng bằng phương pháp trắc quang natriđietylđithiocacbamat (NaDDC) Ion Cu2+ tạo được phức vòng càng với DDC tạo thành phức có màu đỏ nâu, khó tan trong nước nhưng tan nhiều trong các dung môi hữu cơ như CHCl3, CCl4. Trong CHCl3 phức có màu đỏ nâu ánh vàng. Do đó để định lượng đồng bằng thuốc thử này, người ta thường tiến hành chiết trắc quang. Cường độ màu của pha hữu cơ sau khi chiết tỉ lệ thuận với nồng độ đồng trong khoảng khá rộng. Để tăng tính chọn lọc của phương pháp, người ta thường chiết phức CuDDC bằng CHCl3 từ môi trường chứa amoniac, amonicitrat và complexon III là những chất dùng để che các ion cản trở việc xác định đồng. Để xác định đồng dưới dạng CuDDC có thể dùng NaDDC làm thuốc thử hoặc có thể dùng phức PbDDC chiết trao đổi để xác định đồng bằng cách lắc dung dịch phân tích chứa Cu2+ , có pH nằm trong khoảng 1 ÷ 1,5 với dung dịch PbDDC không màu trong CHCl3. Phức đồng bền hơn phức chì nên đồng đẩy chì ra khỏi phức của nó và đồng được chiết hoàn toàn từ pha nước sang pha hữu cơ. Quá trình xác định đồng được tiến hành ở bước sóng 430 nm. 5.1.1.2. Xác định đồng bằng phương pháp trắc quang chì đimetyl đithio cacbamat (PbDDC) Như trên đã nói phản ứng trao đổi giữa Cu(II) và PbDDC xảy ra định lượng trong dung dịch nước có pH = 1 – 1,5. Trong trường hợp này cùng với đồng còn có bimut, thuỷ ngân và bạc tham gia phản ứng trao đổi và cũng chuyển vào tướng hữu cơ. Tuy vậy các nguyên tố khác không tham gia được phản ứng trao đổi, nên phương pháp này có độ chọn lọc cao. Thuỷ ngân và bạc không cản trở việc xác định vì phức của chúng không màu. Bimut chỉ gây cản trở khi nồng độ của nó vượt quá 30µg/l. Nếu nồng độ bimut vượt quá giới hạn trên thì lắc dung dịch hữu cơ chứa DDC của các kim loại đã được chiết trao đổi với 25 ml HCl 5–6 M trong 5 phút, khi đó phức BiDDC bị
- 71. 72 phá huỷ vàbimut lại bị chuyển về tướng nước, trong khi đó CuDDC vẫn còn lại trong tướng hữu cơ. 5.1.1.3. Xác định đồng bằng phương pháp cực phổ Cu (II) có hoạt tính cực phổ, trong nhiều loại nền cho các sóng cực phổ định lượng. Trong đa số các nền cực phổ, sóng của đồng nằm trong khoảng thế khá dương so với các kim loại khác, từ 0 ÷ 0,6V. Vì vậy xác định đồng bằng phương pháp này rất thuận lợi và khá chọn lọc. Nếu trong mẫu phân tích chứa lượng đáng kể chất hữu cơ thì phải vô cơ hoá chúng bằng H2SO4 đặc, HNO3 đặc, và H2O2 làm bay hơi trong tủ hút đến khi xuất hiện hơi SO3. Nếu dung dịch còn có màu thì lại thêm HNO3 đặc và làm bay hơi lần nữa giống như trên động tác này được lặp lại cho tới khi thu được dung dịch không màu. Sau đó làm bay hơi dung dịch đến cạn khô. Phần bã sau khi để nguội được hoà tan trong nước cất 2 lần, đun nóng để hoà tan hết các muối tan, lọc qua phểu lọc khô bằng thuỷ tinh xốp và giữ lấy dung dịch để xác định đồng. Để loại trừ cực đại trên sóng phổ người ta dùng dung dịch gelatin. 5.1.1.4. Phương pháp von – ampe hòa tan xung vi phân Quá trình xác định bằng phương pháp von-ampe hòa tan xung vi phân gồm hai giai đoạn: Giai đoạn 1: Điện phân làm giàu đồng kim loại trên bề mặt vi điện cực màng thủy ngân (catôt): Cu+2 + 2e → Cu . Quá trình này được tiến hành tại thế -1,4V và khuấy dung dịch. Sản phẩm điện phân là kim loại đồng. Giai đoạn 2: Hòa tan kim loại kết tủa trên bề mặt điện cực và ghi dòng hòa tan bằng phương pháp von-ampe kết hợp xung vi phân dưới dạng pic. Trong những điều kiện thích hợp cường độ dòng hòa tan tỷ lệ thuận với lượng đồng đã kết tủa trên bề mặt điện cực tức là nồng độ chất cần xác định trong dung dịch. Đây là phương pháp có độ nhạy, độ chọn lọc và độ lặp lại cao, thực hiện nhanh và khá đơn giản. 5.1.1.5. Phương pháp hấp thụ nguyên tử Phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) dựa vào khả năng hấp thụ chọn lọc các bức xạ cộng hưởng của nguyên tử ở trạng thái tự do. Đối với mỗi nguyên tố, vạch cộng hưởng thường là vạch quang phổ phát xạ nguyên tử của chính nguyên tử đó. Thông thường khi hấp thụ bức xạ cộng hưởng nguyên tử sẽ chuyển từ trạng thái ứng với mức năng lượng cơ bản sang mức năng lượng cao hơn gần với mức năng lượng cơ bản nhất, người ta gọi là bước chuyển cộng hưởng. Trong phương pháp này quá trình nguyên tử hóa có thể thực hiện bằng phương pháp ngọn lửa hoặc bằng phương pháp không ngọn lửa. Trong điều kiện nhiệt độ không quá cao (1500 – 30000 C) đa số hơi nguyên tử tạo thành các trạng thái cơ bản. Khi người ta chiếu vào đám hơi nguyên tử một chùm bức xạ điện từ có tần số bằng tần số cộng hưởng thì các nguyên tử tự do sẽ hấp thụ các bức xạ cộng hưởng này và làm giảm cường độ của chùm bức xạ điện từ. Sự hấp thụ bức xạ của đám hơi tuân theo định luật Lambe – Bia. Thông thường số nguyên tử kích thích trong đám hơi không quá 1 – 2% nên
- 72. 73 phương pháp nàycó độ nhạy và độ chính xác cao, thực hiên nhanh và khá đơn giản. Gần 60 nguyên tố hóa học (chủ yếu là kim loại) có thể xác định bằng phương pháp này với độ nhạy từ 10-3 ÷ 4,10-1 μg/ml. Đặc biệt nếu dùng kỹ thuật nguyên tử hóa không ngọn lửa thì có thể đạt đến độ nhạy 5,10-4 μg/ml với sai số khoảng 15%. Người ta đo đồng ở bước sóng 324,7nm, nếu dùng kỹ thuật nguyên tử hóa bằng ngọn lửa thì đạt độ nhạy 0,03μg/ml, giới hạn phát hiện là 0,02 μg/ml. Nếu sử dụng kỹ thuật không ngọn lửa thì đạt độ nhạy 8.10-3 μg/ml và giới hạn phát hiện là1,5.10-3 μg/ml 5.1.2. Phương pháp xác định kẽm 5.1.2.1. Phương pháp trọng lượng Kẽm kết tủa với 8-hydroxyquinaldinate (2-methyloxin) trong môi trường đệm axetat. Phản ứng này có thể tách kẽm ra khỏi nhôm và magie. Kết tủa thu được đem sấy ở nhiệt độ 130-1400 C, dạng cân là Zn(C10H8ON)2 5.1.2.2. Phương pháp trắc quang. Phương pháp trắc quang dùng dithizon là một phương pháp tiêu chuẩn để xác định kẽm, phức của kẽm với dithizon có màu đỏ, có thể chiết ion kẽm ra khỏi dung dịch dithizon trong CCl4, phản ứng tạo phức tại pH = 4-7, tại pH này các ion của các nguyên tố Cu, Cd, Pb, Co, Bi, Hg, Ag…cũng phản ứng với dithizon. Để loại trừ ảnh hưởng của các nguyên tố này người ta chiết kẽm từ dung dịch nước ở pH = 5 chứa lượng dư SCN- và CN- . Các hợp chất oxi hoá dithizon như Cl2, Br2, I2, H2O2 được loại trừ bằng cách đun sôi dung dịch. Một số chất vô cơ cản trở quá trình chiết và gây đục CCl4, do vậy phải vô cơ hoá bằng H2SO4, HNO3, H2O2. Đo mật độ quang của phức kẽm- dithizon trong pha hữu cơ ở bước sóng 530 nm. 5.1.2.3. Phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử Người ta thực hiện phép đo AAS đối với kẽm ở bước sóng 213,9nm, nếu dùng kỹ thuật ngọn lửa thì đạt độ nhạy 0,008μg/ml, giới hạn phát hiện 0,004μg/ml.Nếu dùng kỹ thuật không ngọn lửa thì đạt độ nhạy 0,007μg/ml, giới hạn phát hiện 0,003μg/ml. 5.1.2.4. Phương pháp cực phổ Kẽm có hoạt tính cực phổ, trong nhiều nền cho sóng cực phổ định lượng. Nguyên tắc của phương pháp là khử ion Zn2+ trên catot là cực giọt thuỷ ngân tạo ra sóng cực phổ, phản ứng xảy ra ở catot Zn2+ + 2e = Zn0 E = -0,7628V Độ nhạy của phương pháp cực phổ chưa cao, chỉ xác định nồng độ các nguyên tố trong khoảng 10-6 – 10-3 M 5.1.2.5. Phương pháp von – ampe hòa tan xung vi phân Thường người ta điện phân làm giàu dung dịch chứa Zn2+ ở điện thế -1,4V, sản phẩm điện phân là kẽm kim loại. Sau đó hòa tan kẽm trên bề mặt của điện cực làm việc, tín hiệu phân tích thu được dưới dạng pic. Điện thế ứng với đỉnh pic là cơ sở của phép phân tích định tính còn chiều cao (cường độ dòng hòa tan) hay diện tích pic là cơ sở của phép phân tích định lượng.
- 73. 74 5.1.3. Các phươngpháp xác định chì 5.1.3.1. Phương pháp trọng lượng Đối với chì người ta người ta thường kết tủa dưới dạng muối khó tan như PbSO4, PbS… hay dưới dạng hợp chất phức chelat. Cản trở của phương pháp này là có nhiều ion kim loại khác cùng kết tủa theo nên phương pháp này hiện nay ít sử dụng. 5.1.3.2. Phương pháp trắc quang Dithizon - diphenylthiocacbazon là thuốc thử hữu cơ có khả năng tạo phức càng cua với hàng loạt ion kim loại, trong đó có chì. Phức chì dithizonat khó tan trong nước nhưng dễ tan và tan nhiều trong các dung môi hữu cơ như CHCl3 hoặc CCl4. Vì vậy, người ta thường dùng phương pháp chiết trắc quang để xác định chì. Trong CCl4 chì dithizonat có màu đỏ, cực đại hấp thụ ở 520nm. Chì dithizonat được chiết chọn lọc và định lượng từ dung dịch nước có pH = 8 ÷ 9 chứa lượng dư xianua là chất dùng để che nhiều kim loại khác có thể cùng bị chiết với chì. Trong môi trường kể trên, cùng bị chiết với chì có cả tali, bitmut và thiếc (II). Tali không cản trở việc xác định chì nhưng thiếc và bitmut ngăn cản nên cần được tách trước bằng cách chiết chúng từ môi trường axit. Trong môi trường axit chì không bị chiết, còn lại trong pha nước. Thiếc và bitmut được tách trước như sau: thêm hidrazin vào dung dịch mẫu nước, đun nóng để khử Sn4+ xuống Sn2+ và khử các chất khác. Sau khi để nguội, thêm dung dịch natri tactrat vào, đưa pH của dung dịch đến 2,5 ÷ 3 (Bằng dung dịch axit tactric). Tiến hành chiết nhiều lần, mỗi lần bằng 5ml dung dịch dithizon 0,1% trong CHCl3. Tiến hành chiết cho đến khi pha hữu cơ vẫn giữ nguyên màu xanh của dithizon. Cuối cùng, lắc pha nước vài lần với CHCl3 (mỗi lần dùng 5ml) đến khi pha đó không còn màu xanh. Tiến hành chiết như vậy không những tách được thiếc mà còn tách được cả thủy ngân, bạc và đồng. Nếu trong mẫu nước chứa lượng đáng kể các chất hữu cơ cần phải vô cơ hóa chúng bằng cách cho vào vài ml HNO3 đặc và HClO4 đặc rồi cô mẫu đến khô, sau đó tẩm ướt bã khô bằng axit nitric và hòa tan bằng nước cất. Các chất oxi hóa cần được khử trước bằng hidrazin. 5.1.3.3. Xác định chì bằng phương pháp cực phổ Ion Pb2+ là một ion có hoạt tính cực phổ, bị khử trên catôt thủy ngân thành chì kim loại. Trong nền NaOH phức Pb(OH)3 - bị khử thuận nghịch và cho sóng cực phổ với thế nửa sóng -0,76V so với cực calomen bão hòa. Nếu trong dung dịch có chứa Fe3+ nhưng hàm lượng không lớn lắm, sắt sẽ bị kết tủa trong nền NaOH và không gây trở ngại đến việc xác định chì. Nếu hàm lượng Fe3+ lớn, kết tủa Fe(OH)3 sẽ hấp phụ chì, trong trường hợp này nên xác định chì theo phương pháp thêm. Nếu trong nước có lượng tương đối lớn Cu2+ , trong môi trường kiềm dư nó cũng bị tan một phần dưới dạng CuO2 2- và sóng của đồng cũng ảnh hưởng đến sự xác định chì. Trong trường hợp này, sau khi đã thêm NaOH vào dung dịch phân tích, để lắng kết tủa, dùng pipet khéo léo lấy ra 10ml dung dịch trong, thêm vào 0,5ml dung dịch KCN 1M để che đồng. Lượng xianua không được dư nhiều vì sự dư nhiều ion này sẽ làm giảm sóng của chì. Khi tính toán cần kể đến sự pha loãng do tăng thể tích dung dịch khi thêm xianua.
- 74. 75 Nếu mẫu nướcchứa lượng đáng kể chất hữu cơ, cần phá hủy chúng như trong phương pháp dithizon đã trình bày ở trên. Để loại trừ oxi không được dùng Na2SO3 vì ion chì sẽ kết tủa dưới dạng PbSO4, đặc biệt trong trường hợp nồng độ chì lớn. Cần dùng luồng khí trơ như N2 hoặc H2 tinh khiết cho chạy qua dung dịch trước khi ghi cực phổ để loại oxi. Dùng dung dịch gelatin để loại trừ cực đại trên sóng cực phổ của chì. 5.1.3.4. Phương pháp Von-Ampe hoà tan xung vi phân Hiện nay người ta sử dụng phương pháp Von-Ampe hòa tan kết hợp với xung vi phân (DPP) có thể xác định 10-9 M Pb2+ với thời gian không quá 3 phút. Có thể nói, hiện nay DPP là phương pháp cực phổ hoàn chỉnh nhất để xác định hàm lượng KLN vì phương pháp có độ nhạy, độ chọn lọc cao và có tính vạn năng đối với hầu hết các đối tượng phân tích. 5.1.3.5. Phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử Đối với chì, người ta thực hiện phép đo AAS tại bước sóng 217nm. Với kỹ thuật ngọn lửa đạt độ nhạy 0,1μg/ml, giới hạn phát hiện 0,02μg/ml. Nếu dùng kỹ thuật không ngọn lửa thì đạt độ nhạy 0,05μg/ml, giới hạn phát hiện 0,01μg/ml. 5.1.4. Một số phương pháp xác định cadimi 5.1.4.1. Phương pháp phân tích trọng lượng Thường dùng là điện phân kết tủa cadimi dưới dạng kim loại, kết tủa cadimi dưới dạng muối khó tan (dạng cân tốt nhất là CdSO4, CdNH4PO4.H2O...), dưới dạng hợp chất phức chelat. Cản trở của phương pháp này là các kim loại đi kèm với cadimi khi kết tủa chúng dưới dạng sunfat từ các dung dịch axit. Hiện nay phương pháp này ít dùng. 5.1.4.2. Phương pháp thể tích Người ta có thể chuẩn độ cadimi bằng phương pháp chuẩn độ complexon trong dung dịch kiềm với chỉ thị eriocrom T đen hoặc chỉ thị xylen da cam. Trong phép chuẩn độ complexon dùng dung dịch chuẩn là EDTA 0.01M, chỉ thị eriocrom T đen ở pH = 10 (đệm NH4Cl + NH3). Cadimi có thể xác định với lượng 25mg/100ml dung dịch. Trong phép chuẩn độ complexon thì dung dịch EDTA có nồng độ từ 0,1 đến 0,01M với chỉ thị xylen da cam ở pH = 6 cadimi có thể định lượng tới 100mg/100ml dung dịch. 5.1.4.3. Phương pháp trắc quang dithizon Để xác định cadimi bằng phương pháp chiết trắc quang dùng dithizon, người ta chiết bằng CCl4 từ môi trường kiềm mạnh chứa tactrat, dung dịch dithizonnat của cadimi trong dung môi hữu cơ có màu đỏ, hấp thụ cực đại ở bước sóng 515nm. Trong môi trường kiềm có một số kim loại cũng bị chiết cùng cadimi như bạc, niken, coban, đồng, để loại trừ các nguyên tố này người ta chiết chúng trong môi trường axit trước khi xác định cadimi. 5.1.4.4. Phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử Phương pháp AAS được ứng dụng để xác định cadimi trong nhiều đối tượng khác nhau. Ở bước sóng 228,8nm thì đạt độ nhạy 0,01μg/ml, giới hạn phát hiện
- 75. 76 0,004μg/ml đối vớikỹ thuật ngọn lửa. Đối với kỹ thuật không ngọn lửa thì đạt độ nhạy 0,008μg/ml, giới hạn phát hiện 0,002μg/ml. 5.1.4.5. Các phương pháp điện hoá Cadimi có thể xác định bằng phương pháp cực phổ. Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên sự khử ion Cd2+ trong môi trường axit, trung tính hoặc kiềm. Trong một khoảng nồng độ nhất định của Cd2+ thì cường độ dòng khuyếch tán (hay chiều cao sóng cực phổ) tỷ lệ với nồng độ Cd2+ theo phương trình Incovich: I = k.C. Phương pháp điện hoá được sử dụng phổ biến hiện nay là phương pháp von- ampe hòa tan anot là một phương pháp xác định cadimi có độ nhạy cao. Đây là phương pháp vừa xác định vừa làm giàu chất phân tích. Trước tiên cadimi được điện phân làm giàu lên điện cực làm việc ở thế không đổi. Sau đó hòa tan Cd bằng cách phân cực ngược anốt rồi ghi lại đường cong von-ampe hòa tan của cadimi. Khi xác định cadimi theo phương pháp cực phổ nếu trong mẫu nước hàm lượng Cu không cao thì có thể xác định đồng thời hai nguyên tố, nếu hàm lượng đồng lớn thì cần che bằng xianua. 5.1.4.6. Các phương pháp khác - Phương pháp đo độ đục: dùng phản ứng của cadimi với Fe[(CN)6]4- hoặc với triphenyl metyl arsoni iodua. Độ nhạy của phương pháp đến 2,3μg/ml. - Phương pháp kích hoạt notron: sử dụng cadimi-114 (giới hạn phát hiện là 30μg) và cadimi-116( giới hạn phát hiện là 0,7μg). Các phương pháp xác định hàm lượng KLN rất đa dạng, tuy nhiên, trong điều kiện phòng thí nghiệm hiện nay, chúng tôi chọn phương pháp Von-Ampe hòa tan xung vi phân dùng điện cực màng Hg điều chế tại chỗ trên điện cực rắn đĩa quay glassy carbon. Tuy nhiên, cho dù sử dụng phương pháp nào đi chăng nữa thì con người và kỹ thuật, kinh nghiệm phân tích vẫn là yếu tố quyết định độ chính xác của phép đo. Sau đây là một số ví dụ xác định hàm lượng kim loại nặng. 5.2. Xác định các kim loại: đồng, chì, kẽm bằng phương pháp Dithizon 5.2.1. Bản chất của phương pháp Dithizon Dithizon (Diphenyl thiocacbazon) có công thức: Dithizon: tan trong Cacbon tetraclorua và Cloroform: có màu xanh lá cây. Trong môi trường nước: Dithizon tồn tại cân bằng: HDz H+ + Dz- Do đó, ở trong môi trường trung tính hay acid, Dithizon ở dạng phân tử nhiều hơn nên chúng ít tan. Ở môi trường kiềm, độ tan của Dithizon tăng do ở dạng ion nhiều hơn. Dithizon tạo với các ion kim loại thành các Dithizonnat có màu, ít tan trong nước nhưng tan nhiều trong Cacbon tetraclorua và Cloroform. Các Dithizonnat tồn tại dưới hai dạng tùy thuộc vào pH của môi trường: S C N NH NH C6H5 N C6H5
- 76. 77 * pH ≤7: chúng tồn tại dưới dạng cetol: * pH 7: chúng tồn tại dưới dạng enol: Dạng enol ít tan trong Cacbon tetraclorua và Cloroform 5.2.2. Nguyên tắc của phương pháp Dithizon - Dùng phưong pháp chiết. - Dùng dung môi Cacbon tetraclorua hay Cloroform. - Cho Dithizon tác dụng với kim loại cần xác định tạo thành Dithizonat. - Điều chỉnh pH để Dithizon được thu hoàn toàn, nghĩa là tách ra khỏi dung môi (Bảng 5.1). Bảng 5.1. Điều kiện chiết tách Pb, Cu và Zn. Nguyên tố Điều kiện chiết, màu Của Dithizonat pH chiết hoàn toàn Dung môi Chiết Chì (Pb2+ ) Đồng (Cu2+ ) Kẽm (Zn2+ ) Môi trường kiềm: đỏ Môi trường acid: đỏ tím Đỏ 7 - 10 2 – 5 6 - 9 CCl4 CCl4 CCl4 5.2.3. Chuẩn bị dung dịch để xác định: chì, đồng, kẽm Các kim loại chì, đồng, kẽm có trong thực phẩm với lượng nhỏ, do đó muốn xác định chúng cần phải vô cơ hóa thực phẩm. 5.2.3.1. Vô cơ hóa bằng phương pháp khô * Nguyên tắc Đốt cháy hoàn toàn các hợp chất hữu cơ có trong mẫu trong lò nung. Trong quá trình đốt cháy cho thêm chất Mg(NO3)2 và ( CH3COO)2Ca để tăng tốc độ đốt cháy và chống việc tạo thành các hợp chất bay hơi của kim loại nặng khi đốt. * Dụng cụ, hóa chất - Capxun dung tích 250ml - Pipet 100ml - Bình định mức dung tích 250ml - Cân kỹ thuật - Phễu - Giấy lọc - Bếp cách cát - Bếp điện - Lò nung - MgO3 - (CH3COO)2Ca - HNO3 đậm đặc (d=1,4) * Tiến hành Lấy mẫu: S C N NH N C6H5 N C6H5 M S C N N N C6H5 N C6H5 M
- 77. 78 - Nếu sảnphẩm lỏng: dùng pipet lấy 100ml mẫu cho vào capxun. - Nếu sản phẩm đặc: cân 100g mẫu cho vào capxun. Vô cơ hóa mẫu bằng phương pháp khô: - Thêm vào capxun 0,5g Mg(NO3)2 và 0,5g (CH3COO)2Ca, các chất này nhất thiết không được chứa Pb, Cu, Zn. - Đặt capxun lên bếp cách cát, đốt cho mẫu cháy thành than. Đặt capxun vào lò nung, nung ở t= 600÷7000 C đến khi mẫu biến hoàn toàn thành tro xám khoảng 3 giờ. - Lấy capxun ra khỏi lò nung, để nguội. Cho vào capxun 20ml HNO3 đđ (tuyệt đối không chứa Cu, Pb) và 50ml nước cất hai lần. Đặt capxun lên bếp điện đun cho tan hết muối bám ở capxun, đun sôi thêm 10 phút nữa (làm trong tủ hút). Định mức dung dịch mẫu: Chuyển toàn bộ dung dịch từ capxun vào bình định mức dung tích 250ml. Tráng rửa capxun nhiều lần bằng nước cất hai lần, nước tráng cũng được cho vào bình định mức. Thêm nước cất đến vạch định mức, lắc kỹ. 5.2.3.2. Vô cơ hóa mẫu bằng phương pháp ướt * Nguyên tắc Đốt cháy hoàn toàn các hợp chất hữu cơ trên bếp điện với sự xúc tác của H2SO4 đđ, là những chất oxy hóa mạnh làm tăng tốc độ của quá trình đót cháy. * Dụng cụ, hóa chất - Dụng cụ như phương pháp khô - Hóa chất: H2SO4 đậm đặc (d=1,84) HNO3 đậm đặc (d=1,4) NH4CH3COO : Amoni acetat * Tiến hành - Lấy mẫu: giống phương pháp khô. - Thêm vào capxun đựng mẫu: 3ml HNO3 đđ, 50ml H2SO4 đđ. Đặt capxun lên bếp điện, đun sôi dung dịch trong capxun. Tiếp tục đun và cứ mỗi phút lại nhỏ thêm 5÷20 giọt HNO3 đđ, khí NO2 màu nâu sẽ thoát ra (làm trong tủ hút). Nếu thấy màu dung dịch trong capxun thẫm lại thì phải tăng tốc độ nhỏ HNO3 đđ. Khi dung dịch trở nên nhạt màu thì giảm tốc độ nhỏ HNO3 đđ đến khi dung dịch không màu thì ngừng. - Tiếp tục đun cho khói trắng bốc hơi hết, tiếp tục đun sôi 10 phút nữa. Nếu dung dịch không màu thì việc vô cơ hóa đã xong. Nếu dung dịch đen trở lại thì lại nhỏ HNO3 đđ. - Lấy capxun ra khỏi bếp điện, cho vào capxun 0,2g NH4CH3COO, khuấy cho tan hết. - Định mức: chuyển toàn bộ dung dịch từ capxun vào bình định mức 250ml, thêm nước cất đến vạch, lắc kỹ. Nếu dung dịch trong capxun bị đục thì phải lọc trước khi chuyển vào bình định mức. 5.2.4. Xác định chì Dùng phương pháp chiết chuẩn độ
- 78. 79 5.2.4.1. Nguyên tắc -Trong môi trường trung tính hay kiềm, ion chì (Pb2+ ) tạo với Dithizon thành chì Dithizonat màu tím đỏ tan trong dung môi hữu cơ. Pb2+ + 2H2Dz = Pb(HDz)2 + 2H+ - Vì Pb(HDz)2 tan rất ít trong dung môi hữu cơ, do đó khi dùng môi trường trung tính thì tốt nhất nên dùng nồng độ của Dithizon trong CCl4 50µM (micro phân tử gram: 12,81 mg/l). Trong CHCl3, Pb(HDz)2 tan gấp 17 lần trong CCl4. Do đó để xác định Pb người ta thường dung CHCl3 để hòa tan Dithizon. - Ở pH 7 việc thu Pb2+ vào dạng Pb(HDz)2 là hoàn toàn. Tuy nhiên pH9,5 thì Pb(HDz)2 trong CHCl3 bị phân hủy. - Trong dung dịch sau khi bị vô cơ hóa có thể có mặt của ion Sn2+ , Cu2+ , Zn2+ , Fe2+ …Các ion này có thể bị che giấu bởi KCN, tuy nhiên Sn2+ không bị che bởi KCN do đó phải tách Sn2+ ra khỏi dung dịch trước khi xác định chì. 5.2.4.2. Dụng cụ, hóa chất - Cần phân tích - Cốc thủy tinh dung tích 250ml - Bình định mức dung tích 1000ml - Phễu chiết dung tích 100ml - Giấy thử pH - Buret 10ml - Dung dịch tiêu chuẩn 25µM: hòa tan 8,28mg Pb(NO3)2 tinh khiết loại I trong nước cất hai lần, đến thành 1000ml, 1ml dung dịch này chứa 5,175g chì. - Dung dịch amoniac 2N - KCN tinh thể - Dung dịch Dithizon tiêu chuẩn (dung dịch Dithizon trong cloruafrom 50µM): Cân chính xác 12,81 mg Dithizon tinh khiết cho vào cốc, thêm 200 ml CHCl3 vào cốc, khuấy nhẹ cho tan Dithizon, định mức trong 1000ml, lắc kỹ. - Hydroxylamin hydroclorua (NH2OH.HCL) tinh thể. - HNO3 2N 5.2.4.3. Tiến hành Loại Sn2+ ra khỏi dung dịch mẫu: - Lấy 25ml dung dịch từ bình đựng mức ( đã vô cơ hóa) cho vào cốc dung tích 250ml. Cho vào cốc 10ml Br2 lỏng và đun trên bếp điện để đuổi hết hơi SnBr4. Tiếp tục đun, thêm nước cất vào, rồi lại tiếp tục đun cho tới khi dung dịch không còn màu đỏ của Brôm. Lúc này dung dịch chỉ còn chứa các ion Pb2+ , Cu2+ , Zn2+ , Fe2+ … Che dấu các ion Cu2+ , Zn2+ , Fe2+ …: - Chuyển dung dịch đã loại Sn2+ vào phễu chiết. Cho vào phễu vài tinh thể NH2OH, HCl, lắc cho tan hết. Cho vào phễu 1 lượng (bằng hạt ngô) tinh thể KCN, lắc cho tan hết. Điều chỉnh pH dung dịch đến pH≥7,5 (theo giấy đo pH) bằng NH4OH 2N hoặc HNO3 2N. Chiết chuẩn độ: - Cho Dithizon 50µM vào buret. Nhỏ 1ml Dithizon vào phễu chiết chứa dung dịch mẫu, lắc 30 giây. Nếu có Pb2+ thì trong thành phần dung môi cloroform sẽ có màu đỏ tím của chì Dithizonat. Chiết bỏ phần màu đỏ tím (phải chiết thật cẩn thận để dung dịch mẫu không chảy ra).
- 79. 80 - Lại chothêm 1ml dung dịch Dithizon vào phễu chiết, lắc 30 giây và tách bỏ màu đỏ tím. - Cứ tiếp tục như trên cho đến khi nào màu của phần dung môi trong phễu chiết kém đỏ, lúc đó lượng Pb2+ trong dung dịch đã giảm đi rất nhiều. Lúc đó nhỏ 0,2ml Dithizon vào phễu chiết, lắc và tách như trên cho đén khi nhỏ Dithizon vào phễu chiết Dithizon vẫn giữ được màu xanh sau khi lắc 30 giây thì thôi. Ghi tổng số ml dung dịch Dithizon đã dùng để chiết chuẩn độ ion chì. Xác định độ chuẩn của Dithizon: - Lấy chính xác 10ml dung dịch chì tiêu chuẩn vào phễu chiết sạch.Nạp dung dịch Dithizon 50µM vào buret. Tiến hành chuẩn độ như trên chẳng hạn hết 15ml dd Dithizon. - Căn cứ vào độ chuẩn của Dithizon này, tính kết quả hàm lượng chì. 5.2.4.4. Tính kết quả Tính: 1ml dd Dithizon ứng với bao nhiêu g chì 1ml Pb(NO3)2 25µM chứa 5,175 γ chì Vậy: 1ml dd Dithizon ứng với số γ chì Hàm lượng chì tính bằng γ có trong 1 lít (hoặc 1 kg) thực phẩm là: ) lit / ( V . V 1000 . V . a . 45 , 3 X 0 1 γ = Trong đó: 3,45 : Số γ chì ứng với 1ml dd Dithizon a : Thể tích dung dịch Dithizon đã dùng để chuẩn độ (ml) V : Dung tích bình định mức (ml) V1 : Thể tích dung dịch hút từ bình đem phân tích (ml) V0 : Thể tích thực phẩm lỏng lấy để phân tích ( nếu là sản phẩm đặc thì G : là lượng cân mẫu - lượng chì tính toán theo γ/kg). 5.2.5. Xác định nồng độ (Cu) Phương pháp chiết chuẩn độ 5.2.5.1. Nguyên lý Dithizon tác dụng với ion Cu2+ xảy ra các phản ứng sau: Cu2+ + 2H2Dz = Cu(HDz)2 + 2H+ Cu2+ + Cu(HDz)2 = 2CuDz + 2H+ Cu2+ + H2Dz = CuDz + 2H+ Cu(HDz)2 : màu đỏ tím CuDz : màu vàng nâu Cu(HDz)2 và CuDz đều tan trong dung môi hữu cơ và không tan trong nước - Trong môi trường acid yếu và có dư Dithizon: việc tạo thành Cu(HDz)2 xảy ra thuận lợi - Trong môi trường trung tính: cả ba phản ứng trên đều xảy ra. - Ở nồng độ đồng cao và pH=2: việc tạo thành CuDz xảy ra thuận lợi. Trong thành phần dung môi hữu cơ, Cu(HDz)2 dễ bị phân ly tạo thành CuDz:
- 80. 81 Cu(HDz)2 = CuDz+ H2Dz -Do các điều kiện trên, để xác định đồng bằng Dithizon, thường tiến hành phản ứng ở pH = 3÷4 để thu Cu2+ dưới dạng Cu(HDz)2 là hoàn toàn. 5.2.5.2. Dụng cụ, hóa chất Dụng cụ: Như phần xác định chì Hóa chất: - Amoniac 2N - H2SO4 2N: Hòa tan 55ml H2SO4 (d = 1,84) vào nước cất thành 1000ml - Dung dịch Dithizon trong cloroform 50µM - Dung dịch đồng tiêu chuẩn: hòa tan 19,64mg CuSO4.5H2O tinh khiết phân tích trong nước cất hai lần, định mức đến 1000ml. 1ml dung dịch này chứa 5γ đồng. 5.2.5.3. Tiến hành - Loại Sn2+ ra khỏi dung dịch mẫu: giống như phần xác định chì - Cho dung dịch đã loại Sn2+ vào phễu chiết. Điều chỉnh pH của dung dịch đến có pH = 3÷4 bằng amoniac 2N hay H2SO4 2N (dùng giấy thử pH). - Chiết chuẩn độ: Chuẩn độ lượng đồng bằng dung dịch Dithizon trong cloroform như cách chuẩn độ chì. - Ghi số ml Dithizon đã dùng. 5.2.5.4. Kết quả Giống như phần xác định chì 5.2.6. Xác định kẽm Phương pháp đo màu 5.2.6.1. Nguyên lý - Trong môi trường trung tính hay kiềm yếu, Zn2+ phản ứng với Dithizon tạo thành phức chất Zn(HDz)2 màu đỏ. Zn2+ + 2H2Dz = Zn(HDz)2 + 2H+ - Phản ứng trên thích hợp khi pH=8,3 tương ứng với dung dịch chiết chứa dung dịch đệm citrat. - Nồng độ Zn2+ càng lớn màu của dung dịch Zn(HDz)2 càng đậm. - Đem đo màu của dung dịch tạo phức chất màu đỏ sẽ xác định nồng độ của Zn2+ trong mẫu. - Phải loại bỏ ion Cu2+ , Pb2+ trước khi xác định Zn2+ . 5.2.6.2. Dụng cụ, hóa chất Dụng cụ: Như phần xác định chì Hóa chất: - Amoniac 2N - Kali-Natri tactrat dung dịch 20% - Dung dịch Natri sunfua Na2S bão hòa - Dung dịch Dithizon trong cloruaform 50μM - Dung dịch kẽm tiêu chuẩn: Cân 43,97mn ZnSO4.7H2O tinh khiết phân tích cho
- 81. 82 vào bình địnhmức dung dịch 100ml, thêm vào 10ml H2SO4 2N, thêm nước cất đến vạch định mức, lắc kỹ. 1ml dung dịch này chứa 10γ kẽm. 5.2.6.3. Tiến hành Loại bỏ ion Cu2+ : - Lấy 25ml dung dịch đã vô cơ hóa (bằng phương pháp khô hay ướt) cho vào phễu chiết. Trung hòa bằng NH3 2N đến pH=7 với giấy thử pH. Cho phễu chiết 5ml dd Dithizon, lắc mạnh phễu chiết 1-2 phút, để yên cho phân lớp. - Tách bỏ lớp dưới có phức đồng-Dithizonat màu đỏ tím. Thêm Dithizon và tiếp tục lắc cho đến khi không có màu đỏ tím ở phần Dithizon. Chiết kẽm bằng Dithizon và loại bỏ chì: - Cho phần dung dịch Dithizon vào một cốc. Cho vào cốc 3ml Kali-Natri tactrat dung dịch 20% để chống kết tủa các hydroxyt kim loại trung hòa bằng NH3 2N. - Chuyển toàn bộ dung dịch từ cốc vào phễu chiết, lắc kỹ. Dung dịch sẽ có lớp màu đỏ của kẽm-Dithizonat. Cho vào phễu chiết 10ml Natri sunfua dung dịch bão hòa (để loại chì và Dithizon dư), lắc kỹ, để yên phễu cho tách lớp. Tách bỏ lớp dưới, tiếp tục rửa với Na2S cho đến khi lớp dưới không màu thì thôi. Đo màu dung dịch mẫu: - Chuyển dung dịch kẽm-Dithizonat màu đỏ vào bình định mức dung tích 25ml, thêm cloroform đến vạch định mức, lắc kỹ. - Đem dung dịch này đo màu trên máy đo màu, trị số đọc được là mật độ quang của dịch mẫu: D1 Đo màu dung dịch kẽm tiêu chuẩn: - Lấy 10ml dung dịch kẽm tiêu chuẩn vào phễu chiết khác. Tiến hành chuẩn độ Zn2+ trong dung dịch này với Dithizon và cũng thu phần dung môi chứa kẽm- Dithizonat màu đỏ vào bình định mức dung tích 25ml. Đo màu trên máy đo màu: - Trị số đọc được là mật độ quang đối với dung dịch mẫu: D0 5.2.6.4. Tính kết quả Hàm lượng kẽm tính theo công thức - Đối với sản phẩm lỏng: 1 1 0 0 2 2 1000 10 V V D V D V Zn × × × × × = + (γ/lít) - Đối với sản phẩm đặc: 1 1 0 0 2 2 1000 10 V V D V D V Zn × × × × × = + (γ/lít) Trong đó: V2 : Số ml dd kẽm tiêu chuẩn (V2 = 10ml) D0 : Trị số mật độ quang đối với mẫu chuẩn D1 : Trị số mật độ quang đối với mẫu phân tích V0 : Thể tích bình định mức (ở phần vô cơ hóa) V1 : Thể tích dung dịch mẫu lấy (ở phần vô cơ hóa) để chiết (ml)
- 82. 83 V : Thểtích mẫu sản phẩm lỏng lấy để phân tích (ml) G : Lượng cân mẫu lấy để phân tích (g) 5.2.7. Xác định thiếc Phương pháp Iod 5.2.7.1. Nguyên tắc - Sau khi vô cơ hóa mẫu thực phẩm, dung dịch chứa thiếc cả hai dạng Sn2+ , Sn4+ . - Dùng hydro khử toàn bộ lượng Sn4+ về dạng Sn2+ . - Cho I2 dư tác dụng với Sn2+ trong môi trường acid. - Xác định I2 thừa bằng chất chuẩn Na2S2O3. Từ đó tính được hàm lượng Sn có trong mẫu. * Các phản ứng xảy ra trong quá trình xác định thiếc: Khi đốt mẫu HNO3 và H2SO4 tác dụng với nhau tạo thành acid nitrozynsunfuric, chất này có tác dụng oxy hóa mạnh các chất hữu cơ và cả Sn2+ . Chất này trong dung dịch nước dễ phân giải. NO và NO2 bay đi khi đun mạnh. Khi đun nóng và có mặt chất hữu cơ, HNO3 phân giải theo phương trình: 2HNO3 = H2O + 2NO + 3O Oxy hoạt động này sẽ oxy hóa các chất hữu cơ thành H2O và CO2, CO2 sẽ bay đi khi đốt. H2SO4 hút nước và phá hủy các liên kết phức tạp của protid, glucid, lipid. Ngoài ra nó cũng bị khử một phần thành SO2. H2SO4 = H2O + SO2 + O Oxy này giúp cho quá trình oxy hóa các chất hữu cơ, còn SO2 bay đi khi đun. Khi nhôm gặp HCl xảy ra phản ứng: Al +3HCl = AlCl3 + 3H Hydro này sẽ khử Sn4+ thành Sn2+ SnCl4 + 2H = SnCl2 + 2HCl Hoặc Sn2+ thành Sn kim loại SnCl2 + 2H = Sn +2HCl Sn kim loại này tan trong HCl Sn + HCl = SnCl2 + 2H Khi CaCO3 gặp HCl sẽ tạo ra CO2 CaCO3 + 2HCl = CaCl2 + CO2 +H2O Phản ứng này được thực hiện trong bình kín Sn2+ oxy hóa bởi Iod trong môi trường HCl: SnCl2 + I2 + 2HCl = SnCl4 + 2HI Phản ứng chuẩn độ I2 bằng Na2S2O3: I2 + 2Na2S2O3 = 2NaI + Na2S4O6 5.2.7.2. Dụng cụ, hóa chất - Pipet 50,25ml - Bình Kendan dung tích 500ml - Bình kíp - Nút cao su
- 83. 84 - Ống thủytinh - Buret - Cân kỹ thuật Hóa chất: - H2SO4 đậm đặc (d=1,84) - HNO3 đậm đặc (d=1,4) - Amoni Oxalat (NH4C2O4) tinh thể- HCl đậm đặc (d=1,19) - Nhôm kim loại (hạt hoặc bột) - Canxi cacbonat (CaCO3) - I2 dung dịch 0,02N - Na2S2O3 0,01N - Hồ tinh bột 1% 5.2.7.3. Tiến hành Vô cơ hóa mẫu: - Lấy mẫu: nếu là sản phẩm lỏng hút 50 ml bằng pipet, nếu là sản phẩm đặc cân 100g. - Cho mẫu vào bình Kenđan. Thêm vào bình 50ml H2SO4 và 10ml HNO3 đđ, lắc đều. - Đun bình Kenđan trên bếp điện để dung dịch trong bình sôi mạnh để hơi nước và khói trắng bốc lên (làm trong tủ hút). Sau đó cho HNO3 vào thêm từng giọt một (đến hết 3-4ml) và tiếp tục đun cho đến khi dung dịch trong bình có màu vàng nhạt lúc để nguội không màu mới thôi. - Cho vào bình 5g amoni oxalat tinh thể để khử hết các hợp chất chứa Nitơ. Đun tiếp trên bếp điện cho tới khi có khói trắng bốc lên. Định mức: - Sau khi để nguội, chuyển toàn bộ dung dịch từ bình Kenđan sang bình nón dung tích 500ml. Dùng nước cất tráng bình nhiều lần, nước tráng cũng cho vào bình nón. Thêm vào bình nón 50ml HCl đđ. Chuyển Sn4+ về dạng Sn2+ : - Đậy bình nón bằng nút cao su có hai lỗ, một lỗ cắm ống thủy tinh để dẫn khí CO2 vào, ống này cắm sát xuống đáy bình nón. Lỗ kia cắm một ống thủy tinh khác dài 10cm và sâu xuống quá nút 3cm. - Cho 0,5 g nhôm (không chứa thiếc) vào bình nón và bắt đầu dẫn khí CO2 từ bình kíp vào, CO2 đuổi oxy của không khí ra khỏi bình nón, chống sự oxy hóa Sn2+ . Đun sôi dung dịch trong bình nón, nếu thấy có kết tủa Sn thì đun kỹ cho tan hết. - Để nguội bình xuống đến nhiệt độ 15÷200 C (dùng nước đá), trong bình lúc này vẫn tiếp tục dẫn CO2 vào bình nón. Cho Sn2+ tác dụng với I2: - Nhanh chóng tháo bình nón ra khỏi bình kíp, mở nút và cho nhanh 25ml dung dịch I2 0,01N (chứa trong buret) lắc mạnh và đều. Dùng nước cất tráng tất cả chất lỏng dính ở nút, ống thủy tinh và thành trong bình vào bình nón. Hình 5.1. Bộ thu khí
- 84. 85 Chuẩn lượng I2dư: - Thêm vào bình nón 1ml dung dịch hồ tinh bột 1%, chuẩn độ I2 dư bằng Na2S2O3 0,01N cho đến khi dung dịch có màu vàng rơm và chuẩn độ đến khi dung dịch mất màu xanh. - Phải chuẩn thật nhanh, tránh oxy không khí vào nhiều ảnh hưởng đến kết quả phân tích. Làm mẫu trắng: - Lấy 25ml I2 0,01 vào bình nón mới, thêm 100ml nước cất, thực hiện chuẩn độ giống như trên đến khi dung dịch mất màu xanh. 5.2.7.4. Tính kết quả Hàm lượng thiếc tính bằng công thức: - Sản phẩm lỏng: V b a Sn 1000 ) ( 5935 , 0 × − = (mg/l) - Sản phẩm đặc: G b a Sn 1000 1000 ) ( 5935 , 0 × × − = (mg/l) Trong đó: a : số ml Na2S2O3 0,01N dùng để chuẩn mẫu trắng b : số ml Na2S2O3 0,01N dùng để chuẩn mẫu phân tích V : thể tích lấy mẫu để phân tích (ml) G : lượng cân mẫu 5.2.8. Xác định Arsen (As) Phương pháp đo màu giấy tẩm thủy ngân bromua với bộ dụng cụ Gutzcit (Hình 5.2). 5.2.8.1. Nguyên tắc - Hợp chất arsen có trong mẫu được khử bởi hydro tạo thành arsen hydrua (AsH3) hay khí arsin. - Arsen hydrua phản ứng với thủy ngân bromua (HgBr2) tẩm trên giấy lọc tạo thành hợp chất màu nâu (Có thể dùng HgCl2 nhưng kém nhạy hơn). - So sánh độ màu của giấy này với dãy giấy tẩm HgBr2 tiêu chuẩn, sẽ tính được lượng Arsen có trong mẫu thử. 1. Bình nón 2. Nút cao su có lỗ 3. Giấy tẩm Pb(CH3COO)2 4. Giấy tẩm HgCl2 Hình 5.2. Bộ dụng cụ Gutzcit
- 85. 86 * Các phảnứng xảy ra trong quá trình xác định Arsen: 1.1. Khi đốt mẫu lương thực, thực phẩm, Arsen ở dạng kim loại hoặc oxyt đều được chuyển sang dạng ion As5+ : 6As + 10HNO3 = 3As2O5 + 10NO +5H2O As2O5 + 3H2O = 2H3AsO4 2H3AsO4 +2MgO = 2MgHAsO4 + 2H2O 1.2. Khi kẽm gặp HCl sẽ có phản ứng: Zn + 2HCl = ZnCl2 + 4H2O Hydro này tác dụng với các muối arsen tạo thành khí Arsin: H3AsO4 + 8H = AsH3 + 4H2O Và AsH3 phản ứng với HgBr2 AsH3 + HgBr2 → Hg3.As. (màu nâu) 1.3. Phương pháp này xác định lượng arsen nhỏ và vì AsH3 là chất dễ bay hơi, nên dụng cụ xác định arsen phải thật kín, nếu không sẽ làm giảm kết quả phân tích, nút cao su không đậy kín bình nón thì phải phủ 1 lớp parafin. 5.2.8.2. Dụng cụ, hóa chất - Ống đong 25ml - Pipet 100ml, 25ml, 5ml - Bình định mức dt 1000ml - Capxun dt 250ml - Cân kỹ thuật - Cân phân tích - Bếp điện - Bếp cách cát - Lò nung điều chỉnh được nhiệt đọ 400-5000 C - Giấy lọc cắt thành dải chữ nhật (0,5x15cm) - Bình nón dt 100ml - Bộ dụng cụ Gutzcit, ống thủy tinh dài 30cm, đường kính 0,7cm, có một lỗ đường kính 0,3cm cách đầu dưới ống 22cm, ống được cắm qua lỗ của nút cao su 3cm. Giấy tẩm HgCl2 được đặt vào trong ống ở khoảng giữa nút và lỗ. Giấy lọc tẩm Pb(CH3COO)2 được cuộn tròn lại và đặt phía trên lỗ. - HNO3 đậm đặc (d=1,4) - HCl đậm đặc (d=1,19) - MgO bột - Kẽm hạt (không chứa Arsen) - Arsen trioxyt tinh khiết phân tích - HgBr2 tinh khiết phân tích: hòa tan 3-6 gam HgBr2 trong 100ml rượu etylic 95% - Pb(CH3COO)2 3% - Giấy tẩm Pb(CH3COO)2, nhúng ngập giấy tẩm lọc (1x8cm) vào Pb(CH3COO)2 3% vớt ra, để khô, cuộn tròn giấy thành ống hình trụ, cho vào đầu trên ống thủy tinh.
- 86. 87 - Giấy, bôngthủy tinh tẩm HgBr2: cho vào dung dịch HgBr2 ít nhất 1 giờ, vớt ra để khô ở tủ hút, trong tối. 5.2.8.3. Tiến hành Chuẩn bị dung dịch thử: - Dùng Pipet lấy 100ml sản phẩm lỏng hoặc cân 100g sản phẩm đặc, cho vào capxun dung tích 250ml. Thêm vào capxun 1g MgO và 10ml HNO3 đđ khuấy đều. - Đặt capxun lên bếp cách cát, đun dung dịch trong capxun cho tới khô. Đưa capxun vào lò nung, nung ở t=400÷5000 C, nung đến tro. -Để nguội, cho vào capxun 10ml HCl đđ (d=1,9) vào 20ml nước cất. -Đặt capxun lên bếp điện đun cho sôi dung dịch đến khi lớp tro tan hết. Để nguội, lọc lấy dung dịch từ capxun vào bình định mức dung tích 50ml, thêm nước cất đến vạch định mức, lắc kỹ. Xác định: - Dùng pipet hút lấy 25ml dung dịch - Dùng pipet hút lấy 25ml dung dịch trong bình định mức, cho vào bình nón dung tích 100ml, thêm vào 5ml nước cất, cho tiếp vào bình nón 10ml HCl đậm đặc và 3g kẽm, nhanh chóng đậy nút lại. - Nút cao su có gắn ống thủy tinh chứa giấy tẩm dung dịch HgBr2 5% đã sấy khô và giấy tẩm Pb(CH3COO)2 3%. Để arsen phản ứng với hydro mới sinh trong 30 phút (kể từ khi đậy nút). Trong quá trình này, giấy tẩm HgCl2 sẽ có màu nâu nếu mẫu có arsen. Sau khi mở nút ra khỏi bình nón, lấy giấy đem so màu với giấy tẩm HgCl2 tiêu chuẩn. Tính kết quả theo lượng arsen ghi trên giấy tẩm HgCl2 tiêu chuẩn, nếu màu của giấy làm mẫu thử và giấy tiêu chuẩn trùng nhau. Chuẩn bị giấy tẩm HgBr2 đậy mẫu tiêu chuẩn: - Cân chính xác 1,32g As2O3 tinh khiết phân tích, cho vào bình định mức dung tích 1000ml. Thêm vào bình định mức 10ml H2SO4 đậm đặc (d=1,84), thêm nước cất đến vạch định mức, lắc kỹ. - Dùng pipet hút lấy 10ml dung dịch đã pha trên, cho vào bình định mức dung tích 1000ml khác, thêm nước cất đến vạch định mức, lắc kỹ, 1ml dung dịch này chứa 10γ As. - Lần lượt cho vào 10 bình nón dung tích 100ml: Bình 1: 2ml dung dịch trên ứng với 20γ As Bình 2: 4ml dung dịch trên ứng với 40γ As Bình 3: 6ml dung dịch trên ứng với 60γ As ……… Bình10: 20ml dung dịch trên ứng với 200γ As - Sau đó thêm nước cất vào từng bình nón cho đủ 30ml và cho vào mỗi bình 10ml HCl đậm đặc và 3g kẽm. Đậy nút bình. - Nút có gắn ống thủy tinh chứa giấy tẩm HgBr2 và giấy tẩm Pb(CH3COO)2 rồi làm như cách làm ở mẫu thử. - Sau 30 phút, các tấm giấy HgCl2 hiện màu đầy đủ. Tháo nút, lấy các tấm giấy
- 87. 88 ra, ghi lượngAs ứng với mỗi giấy lên từng giấy, được dãy màu tiêu chuẩn. - Tùy lượng As tăng dần mà các tấm giấy khi đó có cường độ màu tăng dần (từ màu vàng đến màu nâu đậm) và chiều dài đoạn màu tăng dần từ 0,5cm đến 5cm. 5.2.8.4. Tính kết quả Mẫu thử có màu trùng với màu nào của giấy tiêu chuẩn thì lượng As có trong mẫu ở khoảng đó. Từ đó tính lượng As có trong 1 lít hay 1 kg sản phẩm thực phẩm. 5.2.9. Xác định Flo Phương pháp Thori Nitrat 5.2.9.1. Nguyên lý - Dùng Canxi hydroxyt chuyển Flo sang dạng Canxi florua (CaF2). - Cất Flo bằng máy lôi cuốn bằng hơi nước dưới dạng acid flosilisic (H2SiF6). - Chuẩn độ acid flosilisic (H2SiF6) bằng Thori nitrat Th(NO3)4. Điều kiện để tiến hành phản ứng: a. Dung dịch đệm acid cloacetic pH=3,5-3,8 tạo môi trường acid thích hợp cho việc chuẩn độ hợp chất Flo bằng Thori nitrat. b. Cất lôi cuốn có tác dụng tách biệt Flo khỏi các chất cản trở. Tuy vậy, các BF3, AsF3, MnF4 cũng bay hơi khi cất. c. Chỉ thị hỗn hợp Natri alizarin sunfonat và metylen xanh là chạy nhất đối với thori nitrat. 5.2.9.2. Dụng cụ, hóa chất - Pipet - Capxun - Lò nung - Bếp cách cát - Máy cất lôi cuốn bằng hơi nước - Canxi hydroxyt (Ca(OH)2) rắn - NaOH 0,1N - HCl 0,1N - Silic oxyt bột (SiO2) - Acid photphoric đặc (d=1,69) - Dung dịch Thori nitrat 0,001M: cân chính xác 0,13805g Th(NO3)4.4H2O, hòa tan với nước cất thành 1000ml. - Dung dịch đệm: 200ml acid cloacetic 1M, trung hòa bằng NaOH 0,1N rồi thêm vào 225g acid cloacetic, thêm nước cất thành 1000ml. - Chỉ thị (a): hòa tan 0,125 natri alizarin sunfonat trong 100ml nước cất, khi dùng Hình 5.3. Máy chưng cất lôi cuốn hơi nước 1. Bình nước 2. Bình đựng mẫu (bình cất) 3. Ống làm lạnh 4. Bình thu
- 88. 89 pha loãng 5lần. - Chỉ thị (b): hòa tan 0,01 metylen xanh sunfonat trong 100ml nước cất, khi dùng pha loãng 5 lần. 5.2.9.3. Tiến hành Vô cơ hóa mẫu: - Lấy mẫu: nếu sản phảm lỏng thì dùng pipet lấy 100ml nếu sản phẩm đặc thì cân 100g - Cho mẫu vào Capxun dung tích 125ml. Thêm vào capxun 2g Ca(OH)2, khuấy đều. Đặt lên bếp cách cát, đun đến khô. - Đưa capxun vào lò nung, nung ở nhiệt độ 400÷5000 C, nung đến tro trắng. - Lấy capxun ra, để nguội. Cất mẫu đã vô cơ hóa: - Chuyển tất cả tro từ capxun vào bình cất 2 của máy cất lôi cuốn hơi nước. Rửa capxun bằng 25ml nước cất nóng. Cho vào bình cất 3g silic oxyt và 25ml H3PO4 đậm đặc. - Đun sôi nước trong bình 1 rồi đun bình cất 2. Thu sản phẩm cất trong bình 4 có chứa sẵn 50ml nước cất. Cất đến khi dung dịch trong bình 4 có thể tích 100ml thì ngừng. Chuẩn độ: - Lấy bình nón ra, thêm vào bình nón 1ml natri alizarin sunfonat 0,125% (đã pha loãng 5 lần). Trung hòa NaOH 0,1N đến chuyển màu đỏ. Tiếp đó, nhỏ vào bình nón 1ml metylen xanh 0,01% (đã pha loãng 5 lần) và 10 giọt dung dịch đệm. Kiểm tra pH xem đã đúng pH=3,5-3,8, bằng giấy thử pH. Nếu pH chưa đúng thì nhỏ thêm HCl 0,1N (hay NaOH 0,1N) để điều chỉnh. - Chuẩn độ bằng Thori nitrat 0,001M đến khi dung dịch chuyển màu từ xanh lá cây sang màu tím. Làm mẫu trắng - Cất nước cất (không có mẫu), tiến hành điều chỉnh và chuẩn độ như trên. 5.2.9.4. Tính kết quả Hàm lượng Flo tính theo công thức: - Sản phẩm lỏng: V b a Flo 1000 ) ( 019 , 0 × − × = (mg/l) - Sản phẩm đặc: G b a Flo 1000 ) ( 019 , 0 × − × = (mg/l) Trong đó: a : Số ml Th(NO3)4 0,001 đã dùng để chuẩn mẫu thử b : Số ml Th(NO3)4 0,001 đã dùng để chuẩn mẫu trắng V : Thể tích mẫu lấy để phân tích (ml) G : Lượng cân mẫu để phân tích (g)
- 89. 90 5.2.10. Phân tíchđộc tố Aflatoxin Aflatoxin là những độc tố do nấm mốc Aspergillus flavus và Aspergilus parasiticus sinh ra. Aflatoxin thường tìm thấy và phát triển mạnh trên đậu phụng, ngô, hạt bông, lúa mạch, lúa mỳ, gạo, thức ăn gia súc và một số hạt có G1, G2 là phổ biến nhất. Dưới ánh sáng của đèn tử ngoại (UV), Aflatoxin B cho màu xanh lá cây. Các Aflatoxin M được bài tiết trong sữa bò và sữa mẹ do chuyển từ các loại Aflatoxin B1 là loại độc tố có độc tính mạnh nhất và chủ yếu (hơn 60% trong tổng số Aflatoxin), sau đó đến G1, rồi đến B2, và sau cùng là G2. Đối với người, Aflatoxin là tác nhân gây xơ gan, ung thư gan và tử vong cho rất nhiều người khác nhau. Aflatoxin khi vào cơ thể người và động vật có thể làm giảm sức đề kháng của cơ thể. Ở Việt Nam, quy định về hàm lượng Aflatoxin tối đa cho phép ở thực phẩm cho người ăn là 5ng/g (ppb) đối với Aflatoxin B1 và 10ng/g đối với Aflatoxin tổng số. Đối với thức ăn dành cho trẻ em phải không được phép có Aflatoxin. Các phương pháp sử dụng để phân tích độc tố Aflatoxin hiện nay ở Việt Nam: 1) Định tích BGYF (Bright Green Yellow Fluorescence) 2) Bán định lượng: gồm có - Phương pháp vi cột - Phương pháp cột ái lực miễn dịch và hấp phụ vào típ Florisil (Immuno Affinity Column – IAC) - Phương pháp Elisa (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) - Phương pháp huỳnh quang kế dùng sắc ký cột ái lực miễn dịch 3) Phương pháp định lượng: - Phương pháp sắc ký bản mỏng - Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 5.2.10.1. Phân tích Aflatoxin B1 bằng phương pháp Elisa * Nguyên tắc Phương pháp Elisa (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay): - Phương pháp này nhanh chóng, thao tác đơn giản, có thể bán định lượng nhanh hàm lượng Aflatoxin trong mẫu. Phương pháp này dựa trên sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể. Kháng thể kháng Aflztoxin được phủ lên trên bề mặt các giếng nhựa thử. Aflatoxin trong mẫu sẽ cạnh tranh với Aflatoxin có gắn enzyme vào. Dưới tác động của enzyme, cơ chất sẽ có màu. Càng nhiều Aflatoxin trong mẫu thì càng có ít Aflatoxin gắn enzyme bám được vào kháng thể, do đó màu sẽ hiện lên yếu và ngược lại. - Trong phương pháp Elisa, người ta sử dụng một enzyme dùng làm enzyme đánh dấu, enzyme này sẽ tạo ra phức chất có màu, bền và không độc, nhờ đó có thể thực hiện được phép đo bằng quang kế. Máy móc và phương tiện dùng trong phương pháp này không quá đắt tiền. Ngoài ra, phương pháp này có thể được thực hiện ngay trên hiện trường do tính đơn giản của nó. - Trên nhiều nước, đặc biệt tại châu âu, Elisa được dùng thường xuyên trong các
- 90. 91 phòng phân tíchthực phẩm và nông sản. Do tính dễ sử dụng và giá thành thấp nếu sử dụng nhiều để đo nhiều mẫu, Elisa có khả năng phổ biến rất nhanh. Chi phí đầu tư để huấn luyện và trang bị máy móc để tiến hành các xét nghiệm tương đối nhỏ. Các phòng thí nghiệm trung bình chỉ cần mua một máy đọc Elisa là đủ, ngoài ra các máy khác như máy rửa hoặc máy tự động hút mẫu có thể mua thêm để hỗ trợ nhưng không bắt buộc. * Dụng cụ - Cân phân tích - Máy đọc Elisa (Photometer) - Micro pipet 1,8,12 kênh loại - Máy lắc (để chiết mẫu) 50-200μl - Bình định mức - Máy xay (để xay mẫu) - Ống đong - Ống nghiệm - Cốc thủy tinh - Bình tia nhựa - Máy lắc Vortex - Đồng hồ bấm giây - Khăn giấy - Bút đánh dấu - Pipet tip - Phễu lọc * Hóa chất - Methanol (để chiết mẫu) - Nước cất Các thành phần của bộ kit Elisa để kiểm tra Aflatoxin B1 (nhà sản xuất cung cấp): - Giếng mini phủ kháng thể - Cộng hợp Enzim đặc 10x - Đệm pha cộng hợp - Aflatoxin chuẩn B1 (1,2,4,8 ppb) - Cơ chất A (TMB) - Cơ chất B (Hydroperoxit/đệm axetat) - Dịch hãm - Tween20 5% * Tiến hành Chuẩn bị các thuốc thử: - Pha loãng 1/10 cộng hợp enzyme trong đệm pha công hợp. Lắc đều hỗn hợp một cách nhẹ nhàng. Tránh tạo bọt. Sau khi pha cộng hợp enzyme bảo quản được 6 tháng - Pha dịch rửa: Pha loãng Tween20 trong nước cất để đạt nồng độ 0,05% - Trong vòng 15 phút trước khi sử dụng, pha hỗn hợp cơ chất như sau : Trộn cơ chất A và cơ chất B theo tỷ lệ: 0,5ml cơ chất A/15ml cơ chất B. Chuẩn bị mẫu: - Mẫu đem xay nhỏ, trộn đều, lấy 5g mẫu và 25ml methanol 60% cho vào bình định mức, lắc đều trong vòng 30 phút. - Để lắng trong vòng 10 – 15 phút - Lọc qua giấy lọc, lấy khoảng 10ml dịch lọc đem phân tích. Phân tích mẫu: - Cho vào những giếng đối chứng âm: 50ml methanol 60%, 50μl Aflatoxin B1 chuẩn. - Cho vào những giếng mẫu: 50ml methanol 60%, 50μl dịch chiết đã pha loãng (làm lặp lại tối thiểu mỗi mẫu 2 giếng).
- 91. 92 - Để yêntrong 10 phút. - Sau thời gian ủ, đổ mạnh hỗn hợp ra khỏi giếng vào một chậu đựng nước javen 5%, đập lên khăn giấy, sau đó rửa 5 lần bằng dung dịch rửa. Cách rửa: dùng bình tia đổ đầy dung dịch rửa vào các giếng, để khoảng 5 giây, vẩy mạnh để đổ toàn bộ dịch rửa ra, lặp lại như thế 5 lần. Đập lên giấy nhiều lần cho thật khô nước. - Cho 100μl hỗn hợp cơ chất vào tất cả các giếng, đọc kết quả bằng máy đọc Elisa tại bước sóng 450nm. * Đọc kết quả và tính toán Màu đậm = ít Aflatoxin B1 Màu nhạt = nhiều Aflatoxin B1 Tính độ ức chế màu theo công thức: % Ức chế = 100 1 0 1 × ⎥ ⎦ ⎤ ⎢ ⎣ ⎡ − A A Trong đó: A1 : Mật độ quang của giếng chuẩn hoặc mẫu A0 : Mật độ quang của giếng đối chứng âm Dựa vào % ức chế màu của mẫu, so sánh trên đồ thị Aflatoxin B1 chuẩn sẽ tính được nồng độ Aflatoxin B1 có trong giếng. Từ đó tính ra được nồngđộ Aflatoxin B1 có trong mẫu. Nồng độ Aflatoxin B1 trong mẫu = 5 x Nồng độ Aflatoxin B1 trong giếng 5.2.10.2. Phân tích Aflatoxin bằng sắc ký bản mỏng (TCL) * Nguyên tắc Trên những hạt gel kháng thể đặc hiệu đối với Aflatoxin được gắn đồng hóa trị một cách bền vững nhưng không mất hoạt tính. Các gel này được gắn vào những cột nhỏ. Khi cho dịch chiết mẫu đi qua các cột, Aflatoxin sẽ bị kháng thể giữ lại. Sau khi toàn bộ mẫu dã qua cột, rửa cột trong điều kiện nhẹ nhàng bằng nước cất để loại bỏ tát cả những thành phần không đặc hiệu bám lại. Sau đó Aflatoxin sẽ được giải hấp ra khỏi cột bằng methanol. Định lượng Aflatoxin bằng sắc ký bản mỏng. * Dụng cụ - Cột sắc ký ái lực miễn dịch - Xiranh 20-30ml - Cân phân tích - Microsyringe Halminton 10μl - Micro pipet 1,8,12 kênh loại 50-200, 200-1000μl - Pipet tip - Giấy lọc - Bình chạy TLC - Bơm tay - Bản TLC silicagel 10x10cm - Dụng cụ làm khô gia nhiệt - Bình thổi khí N2 (hoặc bình làm khô chân không) - Máy xay (để xay mẫu) - Bình định mức - Ống nghiệm - Ống đong - Phễu lọc - Cốc thủy tinh - Bình tia nhựa - Máy lắc Vortex - Khăn giấy * Hóa chất
- 92. 93 - Dung dịchchiết mẫu: Methanol/nước cất (75:25) - Methanol HPLC grade (để chiết mẫu) - Aflatoxin chuẩn B1 trong Benzen-Acetonitrit (98:2) - Dung dịch triển khai: Chloroform-Aceton (9:1) - Máy soi đèn UV 365nm - Nước cất * Tiến hành Chuẩn bị mẫu: - Xay 1kg mẫu đủ lọt sàng 1mm. Trộng đều, cân 25g mẫu, 5g NaCl và 125ml dung dịch chiết mẫu methanol 75% cho vào bình định mức. Lắc đều trong 30 phút. - Để lắng trong vòng 10-15 phút. - Lọc dịch chiết qua giấy lọc. - Lấy 15ml dịch pha loãng 1/3 với nước lọc lại lần nữa, lấy 15ml dịch lọc (tương đương 1g mẫu). Phân tích mẫu: Qua cột sắc ký ái lực miễn dịch: - Gắn xiranh 20-30ml lên giá đỡ. Mở nắp cột sắc ký ái lực miễn dịch cho đầy nước vào trong ống (để tránh tạo bọt khí trong cột) và gắn vào xiranh. - Cho 20ml PBS qua cột để rửa cột. - Khi lớp nước vừa tới đầu cột cho 15ml dịch chiết mẫu đã lọc vào xiranh (tránh có bọt khí trong cột) - Cho dịch lọc chảy qua cột với tốc độ khoảng 1giọt/giây. Dùng bơm tay để điều chỉnh tốc độ dòng chảy. - Khi dịch mẫu tới đầu cột, cho 10ml nước cất vào xiranh để rửa cột. Lặp lại một lần nữa với 10ml nước cất. - Khi toàn bộ nước đã ra khỏi cột, bơm 2-3ml không khí qua cột để cột ráo nước. Tháo cột ra khỏi xiranh, lau nước bám ở đầu cột và xiranh. Gõ nhẹ cột lên khăn giấy để hoàn toàn ráo nước. - Cho 1ml methanol (LC grade) rửa giải qua cột, hứng lấy dịch chảy ra. Để methanol chảy từ từ qua cột, cuối cùng dùng xiranh thổi 2-3ml không khí để đẩy hết những giọt cuối cùng ra khỏi cột. Định lượng bằng sắc ký bản mỏng (TLC): - Làm khô dịch giải hấp thu trong N2 ở 40-450 C. Hòa tan cặn lại trong 200μl Benzen-Acetonitrl (98:2). - Trên tấm bản silicagel kẻ một đường cách cạnh đáy 1,5cm, trên đó chấm nhẹ bằng bút chì cách nhau 1cm trở lên. - Chuẩn bị Aflatoxin B1 0,5ppm pha trong Benzen-Acetonitril (98:2). - Dùng Microsyringe chấm lên bảng silicagel từ trái sang phải theo thứ tự sau: + 3 chấm mẫu: 2,5,10μl + 1 nội chuẩn: 10μl mẫu và 10μl chuẩn (0,5ppm Aflatoxin B1). + 3 chấm chuẩn: 10,5,2μl chuẩn (0,5ppm Aflatoxin B1).
- 93. 94 Lưu ý: Chấmtrong tủ hút để dung môi bay hơi nhanh, chấm từ từ để các chấm thật nhỏ, kích thước chỉ khoảng 1mm/chấm. - Pha dung môi: Chloroform-Aceton (9:1). Cho khoảng 20ml dung môi vào bình sắc ký. Cho bản silicagel vào bình, đậy kín. Chờ cho dung dịch triển khai lên đến cách mép trên của bản khoảng 0,5cm. - Lấy bản ra, làm khô tại nhiệt độ phòng. Soi trên đèn UV. Các chấm Aflatoxin B1 sẽ phát sáng. - So sánh các chấm chuẩn với các chấm mẫu. Để khẳng định mẫu có nhiễm Aflatoxin B1 thì Rf của các chấm chuẩn phải bằng Rf của các chấm mẫu. - So sánh độ sáng của các chấm chuẩn và chấm mẫu, chọn một thể tích là Xμl mẫu có độ phát sáng bằng S μl chuẩn. - Tính toán nồng độ Aflatoxin B1 có trong mẫu. * Đọc kết quả và tính toán Nồng độ Aflatoxin B1 có trong mẫu: Aflatoxin B1 = W X V Y S × × × (μg/kg hoặc ppb) Trong đó: S: Thể tích của Aflatoxin chuẩn có độ sáng bằng Xμl mẫu (μl) Y : Nồng độ Aflatoxin B1 chuẩn (0,5μg/ml hoặc 0,5ppm) V : Thể tích hòa tan cặn (200μl) X : Thể tích của mẫu có độ sáng bằng Sμl chuẩn W : Số gam mẫu đi qua cột (1g) Chú ý an toàn khi tiếp xúc với Aflatoxin: - Đeo găng tay khi làm thí nghiệm - Các vết Aflatoxin phải được lau sạch bằng nước javen 10% - Dụng cụ thủy tinh hay nhựa đã tiếp xúc với Aflatoxin phải được ngâm trong nước javen 10% tối thiểu là 30 phút trước khi rửa.
- 94. 95 CHƯƠNG 6 ĐÁNH GIÁMỘT SỐ MẶT HÀNG THỰC PHẨM 6.1. Bột mỳ 6.1.1. Phương pháp lấy mẫu Nếu bột mỳ chứa trong bao thì tùy theo số lượng bao mà lấy mẫu: - Dưới 200 bao, lấy mẫu trong 20 bao. - Từ 201 bao đến 1000 bao, lấy mẫu trong 23 bao. - Trên 1000 bao, lấy mẫu trong 23 đến 30 bao. Nếu bột mỳ đổ thành đống: - Đống to lớn 100 tạ, lấy 20 chỗ. - Đống từ 101 đến 500 tạ, lấy 22 chỗ. - Đống từ 501 đến 1000 tạ, lấy 23 chỗ. - Đống trên 1000 tạ, lấy 30 chỗ. Mỗi mẫu như vậy lấy từ 100g đến 500g, đem trộn đều cho cả lô hàng, rồi rây đi rây lại cẩn thận 3 lần. Dàn mỏng đều thành hình tròn hoặc hình vuông, cắt chéo thành 4 phần bằng nhau, lấy 2 phàn đối diện. Trộn đều và lại chia lại như trên cho đến khi mẫu thử còn khoảng 1000g, đóng gói tránh ẩm ướt và các chất lạ lẫn vào. 6.1.2. Xác định trạng thái cảm quan Màu sắc bột mỳ được xác định và biểu thị thành các màu trắng, xám, trắng ngà… Bột mỳ tốt có màu trắng hoặc trắng ngà, mịn, tơi, có mùi thơm dễ chịu, không có mùi lạ: đắng, chua, ôi khét, không được có mùi mốc, mọt và các mùi lạ khác. 6.1.3. Xác định chỉ số lý hóa 6.1.3.1. Xác định độ ẩm Độ ẩm của bột mỳ được xác định theo phương pháp sấy ở 1050 C đến khối lượng không đổi (xem chi tiêt ở chương 3) 6.1.3.2. Xác định độ chua * Nguyên tắc Dùng dung dịch NaOH chuẩn để trung hòa hết các acid trong mẫu với phenolphtalein làm chỉ thị màu. * Tiến hành Cân 5g bột mỳ cho vào bình nón 250ml, thêm 50ml nước cất và lắc đều để làm tan hết bột. Thêm vào bình 3-5 giọt chỉ thị phenol phtalein và chuẩn đọ bằng dung dịch NaOH 0,1N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt bền. * Kết quả Độ chua là số ml dung dịch NaOH 0,1N tác dụng hết với lượng acid có trong 100g bột mỳ.
- 95. 96 X= G VNaOH 100 × (0 ) 6.1.3.3. Xácđịnh hàm lượng tro Hàm lượng tro được xác định bằng cách nung thành tro trắng rồi cân ( xem chi tiết ở chương 3) 6.1.3.4. Xác định hàm lượng và chất lượng gluten * Nguyên tắc Gluten là thành phàn chủ yếu của bột mỳ. Gluten gồm hai chất gliadin và glutenin. Hai chất này có tính chất dính cao, không tan trong nước mà khi nhào với nước, chúng trương nở và tạo thành khối dẻo đàn hồi. Các tính chất này là cơ sở để xác định hàm lượng gluten. * Tiến hành Xác định hàm lượng gluten ướt: - Cân 25g bột mỳ cho vào chén sứ. Nhào mẫu với 15ml nước ở nhiệt độ thường, dùng đũa trộn đều cho đến khi thành một khối đồng nhất. Dùng dao vét các mảnh bột dính vào chén, vê khối bột thành hình cầu, cho vào chén và đậy bằng tấm kính. - Để yên 20 phút ở nhiệt độ phòng. Lấy cục bột rửa dưới tia nước nhỏ. Tay trái cầm cục bột, nắm các ngón tay lại và đưa vào vòi nước, tay phải điều chỉnh dòng nước chảy nhẹ. Khi gluten trở thành đàn hồi thì tăng tốc độ dòng nước lên cho đến khi gluten sạch hết bột. - Kiểm tra quá trình rửa bằng cách sử dụng một trong các cách sau: + Cho vào nước vắt từ gluten một vài giọt dung dịch Iot trong kali iotdua (0,2g kali iotdua và 0,1g iot tinh thể hòa tan trong 100ml nước), dung dịch không có màu xanh là đã rửa hết tinh bột. + Nhỏ 2-3 giọt nước vắt từ gluten vào một cốc nước trong, thấy nước không đục là được. - Ép khô khối gluten: Đặt khối gluten giữa 2 lòng bàn tay ép mạnh, thỉnh thoảng thấm tay bằng khăn khô. - Cân gluten đã ép khô với độ chính xác đên 0,01g. Khối lượng cân được là khối lượng gluten ướt của mẫu. Xác định hàm lượng gluten khô: - Sấy khối gluten ở nhiệt đọ 1050 C, thời gian 1 giờ sấy đến khối lượng không đổi. Cân lượng chất gluten vừa sấy được M2. Đánh giá chất lượng gluten: Chất lượng gluten ướt được đặc trưng bằng màu sắc, độ căng, độ đàn hồi - Nhận xét màu sắc trước khi cân gluten Màu sắc được đặc trưng bằng các mức độ sau: Trắng ngà, xám, sẫm… - Xác định độ căng Sau khi xác định độ màu, cân 4g gluten. Vê thành hình cầu rồi ngâm trong chậu nước có nhiệt độ 16-200 C trong 15 phút. Sau đó dùng hai tay kéo dài khối gluten trên
- 96. 97 thước chia milimetcho đến khi đứt, tính chiều dài từ lúc đứt. Thời gian kéo 10 giây. Khi kéo không được xoắn sợi gluten. - Đánh giá độ đàn hồi Dùng khối lượng còn lại sau khi đánh giá độ căng. Dùng hai tay kéo dài miếng gluten trên thước khoảng 2 cm rồi buông ra, hoặc dùng ngón tay trỏ và ngón tay trái bóp miếng gluten. Đánh giá chất lượng Gluten Màu sắc gluten: - Màu trứng ngà hoặc màu vàng xám : gluten tốt - Màu xám : gluten xấu Độ căng: -Loại gluten có độ căng kém : 8 cm thì đứt -Loại gluten có độ căng trung bình : 15 cm thì đứt -Loại gluten có độ căng cao : 20 cm thì đứt Gluten loại I: Độ dẻo tốt độ giãn dài khá hoặc trung bình Gluten loại II: Độ dẻo tốt độ dãn dài kém hoặc độ dẻo vừa độ dãn dài trung bình Gluten loại III: Độ dẻo kém không dãn dài hoặc dãn dài kém * Tính kết quả Hàm lượng gluten (ướt) tính bằng % theo công thức: X = 0 1 100 M M × (%) Trong đó: M0 : Lượng cân mẫu (g) M1 : Khối lượng gluten ướt (g) Hàm lượng gluten (khô) tính bằng % theo công thức X = 0 2 M 100 M × (%) Trong đó: M0 : Lượng cân mẫu (g) M2 : Khối lượng gluten khô (g) 6.1.4. Xác định chỉ số vi sinh 6.1.4.1. Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí ( xem chi tiết ở chương 4). 6.1.4.2. Xác định tổng số nấm men, nấm mốc ( xem chi tiết ở chương 4) 6.1.4.3. Xác định Coliforms (xem chi tiết ở chương 4). 6.1.4.4. Xác định E.coli (xem chi tiết ở chương 4). 6.1.4.5. Xác định Clostridium perfringens (xem chi tiết ở chương 4). 6.2. Bánh quy 6.2.1. Phương pháp lấy mẫu Bánh thường được bao thành gói với khối lượng mỗi gói 500g hoặc 250g. Lấy mẫu đầu tiên khoảng 5-10% tổng đơn vị bao gói, rồi từ mẫu đầu tiên lấy 10% làm mẫu
- 97. 98 trung bình. Nếumẫu trung bình có khối lượng từ 2-3kg thì nó đồng thời là mẫu phân tích. Nếu mẫu trung bình lớn hơn 3kg thì cẩn thận bóc các lớp giấy gói, lấy toàn bộ các chiếc bánh ra khỏi gói, xếp lên mặt bàn khô, sạch và lấy một nửa làm mẫu phân tích (chú ý lấy cả bánh nguyên, bánh vỡ, gãy và mốc, hỏng nếu có). 6.2.2. Xác định trạng thái cảm quan Màu đặc trưng của bánh đồng đều, màu không được đậm, hoặc màu trắng, hơi sống hoặc lốm đốm trắng, hoặc nâu đen. Bề mặt bánh láng đẹp, nguyên vẹn, chữ và vân hoa rõ nét không biến dạng, khuyết tật, không được có tạp chất. Bánh giòn, xốp, không ỉu mềm, chai cứng. Có vị đặc trưng của sản phẩm, hài hòa, hậu vị tốt, không được có vị lạ hay vị của sản phẩm hư hỏng 6.2.3. Xác định chỉ số lý hóa 6.2.3.1. Xác định tỷ trọng Độ xốp là một chỉ tiêu quan trọng của chất lượng bánh bích quy, nó đặc trưng cho độ nở và độ tiêu hóa của bánh. Độ xốp của bánh quy được xác định gián tiếp thông qua việc xác định tỷ trọng của bánh quy. * Nguyên tắc Xác định tỉ trọng bằng cách bỏ bánh quy đã biết trước khối lượng và đã được bọc một lớp parafin vào nước: dựa vào sự thay đổi khối lượng bánh bích quy trong không khí và trong nước tính được tỷ trọng của bánh. * Tiến hành - Cân khối lượng một chiếc bánh, cho vào chén sứ có parafin nóng chảy và để nguội. Cân bánh đã được phủ lớp parafin. Hiệu số khối lượng bánh sau và trước khi parafin hóa sẽ cho ra khối lượng parafin. - Cân khối lượng giá treo trong không khí, sau đó cho nó vào cốc nước cất có nhiệt độ 200 C để cân khối lượng trong nước. Lấy hiệu số của khối lượng giá treo trong không khí và nước ta có thể tích của giá treo. - Sau đó đặt bánh bích quy đã nhúng parafin vào trong giá treo rồi tiến hành cân tương tự như trên để xác định thể tích của giá treo và bánh bích quy có bọc lớp parafin. * Kết quả Công thức xác định tỷ trọng bánh bích quy: D = C B A m − − Trong đó: m : khối lượng bánh bích quy (g) A : thể tích giá treo và bánh bích quy nhúng parafin (cm3 ) B : thể tích giá treo (cm3 ) C : Thể tích parafin = khối lượng parafin/0,9 Người ta quy ước bánh quy có độ xốp cao khi tỷ trọng không lớn hơn 0,6g/cm3 , xốp trung bình – 0,63, xốp kém – trên 0,64.
- 98. 99 6.2.3.2. Xác địnhđộ ẩm Xác định độ ẩm bằng phương pháp sấy khô 100-1050 C đến trọng lượng không đổi (xem chi tiết ở chương 3). 6.2.3.3. Xác định độ kiềm * Nguyên tắc Xác định độ kiềm của bánh bằng phương pháp trung hòa với dung dịch H2SO4 0,1N với chỉ thị là Bromthymol xanh. * Tiến hành Cân 5g bánh quy đã nghiền nhỏ, hòa tan bằng nước cất rồi cho vào bình định mức 100ml, thêm nước cất đến vạch định mức. Lắc mạnh 5 phút rồi để yên 30 phút sau đó lắc đều. Lọc dung dịch trong bình qua bông lọc. Hút 25ml dung dịch lọc cho vào bình nón 250ml, thêm 3-5 giọt chỉ thị Bromothymol xanh. Chuẩn độ dung dịch trong bình nón bằng H2SO4 0,1N cho đến khi dung dịch chuyển màu đột ngột từ xanh sang vàng. * Tính kết quả Độ kiềm của bánh quy là số ml dung dịch H2SO4 0,1N dùng trung hòa hết lượng kiềm có trong 100g bánh. Độ kiềm được tính theo công thức sau: X = 10 100 1 × × × × G V V a (0 ) Trong đó: a : thể tích dung dịch H2SO4 0,1N đã dùng để chuẩn độ (ml) V : thể tích bình định mức (ml) V1 : thể tích dung dịch lấy để chuẩn độ (ml) G : lượng cân mẫu (g) 6.2.3.4. Xác định hàm lượng tro Xác đinh hàm lượng tro bằng phương pháp nung thành tro trắng rồi cân (xem chi tiết ở chương 3). 6.2.3.5. Xác định hàm lượng chất béo Hàm lượng chất béo được xác định theo phương pháp Soxhlet (xem chi tiết chương 3). 6.2.4. Xác định các chỉ tiêu vi sinh 6.2.4.1. Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí (xem chi tiết ở chương 4). 6.2.4.2. Xác định Colifroms (xem chi tiết ở chương 4). 6.2.4.3. Xác định E.coli (xem chi tiết ở chương 4). 6.2.4.4. Xác định Clostridium perfringens (xem chi tiết ở chương 4). 6.3. Kẹo 6.3.1. Phương pháp lấy mẫu Các sản phẩm kẹo thường được bao gói thành từng chiếc. Tùy lượng mẫu, có thể lấy từ 5-10% khối lượng lô hàng làm mẫu đầu tiên, rồi trộn đều, lấy 5-10% mẫu đầu
- 99. 100 tiên làm mẫutrung bình, rồi lại trộn đều, lấy 5-10% mẫu trung bình làm mẫu phân tích. 6.3.2. Xác định trạng thái cảm quan Màu sắc đồng đều, đặc trưng cho loại kẹo, hình dạng đẹp, không có khuyết tật. Trạng thái bên trong phải đặc trưng với từng loại kẹo. Mùi vị đặc trưng với từng loại kẹo, thơm, ngọt, dịu, kẹo không bị hồi đường và không có vị lạ. 6.3.3. Xác định chỉ số lý hóa 6.3.3.1. Xác định độ ẩm Độ ẩm của kẹo được xác định theo phương pháp sấy ở 800 C đến khối lượng không đổi (xem chi tiết ở chương 3). 6.3.3.2. Xác định độ hòa tan và lượng tạp chất không tan Độ hòa tan của kẹo là hàm lượng các chất tan trong nước nóng. Độ hòa tan được xác định bằng cách cân một lượng mẫu cho vào cốc có 100ml nước cất, tiến hành đun sôi trên bếp điện và khuấy nhẹ cho đến khi kẹo tan hêt. Sau đó, lọc dung dịch ngay khi còn nóng qua giấy lọc hai lớp (đã biết khối lượng).Tráng rửa cốc và cặn trên giấy lọc nhiều lần bằng nước cất nóng. Để 10 phút cho giấy lọc ráo nước. Sấy khô giấy lọc ở 1050 C đến khối lượng không đổi. Lượng tạp chất không tan của kẹo được tính theo công thức: Lượng tạp chất không tan = 100 – độ hòa tan (%) 6.3.3.3. Xác định hàm lượng tro Xác định hàm lượng tro bằng phương pháp nung thành tro trắng rồi cân (xem chi tiết ở chương 3). 6.3.3.4. Xác định hàm lượng đường hoàn nguyên Theo phương pháp Bertrand (xem chi tiết ở chương 3). Hàm lượng đường này thường không quá 30%. Nếu hàm lượng đường này quá cao, kẹo dễ hút nước, ẩm và dễ chua. 6.3.3.5. Xác định hàm lượng đường chung Đường chung của kẹo là tổng các loại đường sau khi đã được thủy phân ở 700 C trong 5 phút. Hàm lượng đường sau khi thủy phân được xác định theo phương pháp Bertrand (xem chi tiết ở chương 3). 6.3.3.6. Xác định độ acid hoặc độ kiềm Xác định độ acid (độ kiềm) của kẹo bằng phương pháp trung hòa với dung dịch NaOH 0,1N (H2SO4 0,1N) với chỉ thị là phenolphtalein. 6.3.3.7. Xác định hàm lượng chất béo Xác định hàm lượng chất béo theo phương pháp Soxhlet. Xác định chỉ số chứng minh độ hư hỏng của chất béo, các chỉ số này phải âm tính. 6.3.4. Xác định các chỉ tiêu vi sinh Dùng 20 bình nón, mỗi bình chứa 20g kẹo, đổ nước vô khuẩn vào và lắc cho tan hết, rồi thêm từ từ nước đến khi vừa đủ 100ml. Đem một trong hai bình đun sôi 15 phút, sau đó bù phần nước bốc hơi cho đủ 100ml
- 100. 101 Dung dịch nướcđường không đun thì dùng để tìm tổng số vi khuẩn hiếu khí, E.coli, vi khuẩn gây bệnh nấm mốc. Còn dung dịch đường đã đun thì tìm vi khuẩn có nha bào. Các chỉ số vi sinh cần xác định bao gồm: 6.3.4.1. Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí Pha loãng dung dịch nước đường chưa đun sôi thành các dung dịch 1/100, 1/1000, 1/10000, theo cách pha loãng thông thường. Cho vào 3 hộp lồng, mỗi hộp 1ml dịch pha loãng trên, 15ml thạc thường đã đun chảy và để nguội đến 450 C, sau đó cho vào tủ ấm 370 C. Sau 24-48 giờ, đếm khuẩn lạc và tính tổng số khuẩn lạc trong 1g thực phẩm. 6.3.4.2. Xác định nấm mốc Dùng dung dịch nước đường chưa đun pha loãng thành nhiều đậm độ khác nhau. Cho 1ml dung dịch nước đường chưa đun pha loãng vào 3 hộp lồng, rồi đỏ 15ml thạch Sabouraud đã điều chỉnh pH đến 3,5 bằng acid lactic, để ở nhiệt độ 25-300 C, sau 5 – 7 ngày, nếu thấy nấm mọc, thì tùy theo từng nhóm nấm khác nhau, cấy vào môi trường định loại thích hợp để đọc kết quả. Dựa vào hình thái đại thể và vi thể để nhận định loại nấm. 6.3.4.3. Xác định E.coli Cấy dung dịch nước đường vào môi trường Kessler và nước pepton, khi thấy vi khuẩn phát triển thì theo dõi hiện tượng sinh indol trong môi trường pepton, hiện tượng sinh hơi trong môi trường Kessler. 6.3.4.4 Xác định cầu khuẩn gây bệnh Cấy nước đường chưa đun vào canh thang glucoza. Để tủ ấm 370 C, sau 24 giờ cấy chuyển sang môi trường Chapmann để tìm tụ cầu khuẩn gây bệnh, và cấy chuyền sang môi trường thạch máu để tìm liên cầu khuẩn. 6.3.4.5. Xác định vi khuẩn kị khí sinh H2S Lấy 6 ống thang gan, gạn bỏ nước, cấy vào mỗi ống 2ml dung dịch nước đường đã đun. Để tất cả ống vào nồi cách thủy 750 C trong 15 phút. Để lên trên các ống đó 5ml môi trường thạch thường đã đun chảy và để nguội đến 450 C. Làm lạnh ngay bằng cách cho vào tủ lạnh hoặc ngâm nước lạnh. Để toàn bộ vào tủ ấm 370 C, sau 72 giờ, nếu có vi khuẩn phát triển, thạch sẽ bị nứt ra và có mùi hôi thối. 6.3.4.6. Xác định vi khuẩn kị khí chịu nhiệt và sinh H2S Nuôi cấy dung dịch đường pha loãng và đã đun sôi, trên môi trường Wilson Blair, nếu có Welchii sẽ có khuẩn lạc màu đen Nhận định kết quả: Đường dùng ăn thẳng, kẹo mứt, mật ong không được có E.coli, các vi khuẩn gây bệnh, nấm mốc, nấm men. 6.4. Nước chấm Nước chấm là sản phẩm của sự thủy phân các chất đạm thực vật (khô lạc, khô đậu tương) hoặc đạm động vật (cá, tôm, cua, tép) bằng men proteaza trong nấm men,
- 101. 102 nấm mốc (nướcchấm lên men), hoặc bằng dung dịch acid clohydric, rồi trung hòa bằng NaOH, Na2CO3 (nước chấm hóa giải). Nước chấm thường chứa trong bao gói là các chai có dung tích 0,5 lít hoặc 1 lít. 6.4.1. Xác định trạng thái cảm quan - Nước chấm tốt có màu nâu nhạt đến nâu, không có váng, trong. - Mùi thơm đặc trưng, không có mùi khét hoặc các mùi khác lạ. - Vị ngọt dịu, không khé cổ, không có các vị lạ khác. 6.4.2. Xác định chỉ số lý hóa Tất cả các chỉ số hóa học đều tiến hành phân tích trên nước chấm pha loãng 1/20. 6.4.2.1. Xác định độ acid Xác định độ acid bằng phương pháp trung hòa với phenolphtalein làm chỉ thị. Độ acid trong nước chấm cao hơn trong nước mắm, và độ acid trong nước chấm lên men lại cao hơn trong nước chấm hóa giải. Thông thường độ acid của nước chấm từ 8-10. 6.4.2.2. Xác định hàm lượng muối NaCl Hàm lượng muối ăn trong nước chấm được xác định theo phương pháp Morh. Lấy 5ml mẫu thử đã pha loãng cho vào bình nón 250ml, thêm 20ml nước cất và 0,5ml dung dịch K2CrO4 5%. Chuẩn độ bằng dung dịch AgNO3 0,1N cho đến khi xuất hiện hết tủa đỏ gạch Ag2CrO4. Hàm lượmg muối ăn được tính theo công thức: NaCl = V 20 1000 V 00585 , 0 1 × × × (g/l) Trong đó: V1 : Thể tích dung dịch AgNO3 0,1N tiêu tốn để chuẩn độ (ml) V : Thể tích mẫu đã pha loãng đem phân tích (ml) 20 : Hệ số pha loãng mẫu Hàm lượng muối ăn trong nước chấm từ 200-250 g/l 6.4.2.3. Xác đinh hàm lượng nitơ toàn phần Xác định hàm lượng nitơ toàn phần theo phương pháp Kenđan (xem chi tiết ở chương 3). 6.4.2.4. Xác định hàm lượng nitơ foocmon (xem chi tiết ở chương 3). 6.4.2.5. Xác định hàm lượng nitơ (xem chi tiết ở chương 3). 6.4.2.6. Xác định hàm lượng Aflatoxin (xem chi tiết ở chương 4). 6.4.2.7. Xác định các kim loại nặng (xem chi tiết ở chương 4). 6.4.3. Xác định các chỉ tiêu vi sinh 6.4.3.1. Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí Pha loãng nước chấm thành các dung dịch có đậm độ 1/10,1/100, 1/1000 Cho 1ml dung dịch pha loãng trên ( mỗi đậm độ làm 3 mẫu song song) vào hộp petri, đổ thêm 15ml thạch thường đã đun chảy và để nguội 450 C, láng đều. Sau khi thạch đông, để tủ ấm 370 C. Sau 24-48 giờ, đếm các khuẩn lạc và tính kết quả trên 1ml nước chấm.
- 102. 103 6.4.3.2. Xác địnhE.coli Lấy 1ml nước chấm, cho vào một ống môi trường pepton, có cho thêm 0,34ml dung dịch phenic 5% và 1ml nước mắm cho vào một ống canh thang lactoza 1% có ống Đunham Để trong tủ ấm 420 C, sau 24 giờ, theo dõi tính chất sinh indol ở ống nước pepton và tính chất lên men, sinh hơi ở ống môi trường lactoza. Nếu cả hai hiện tượng trên đều có và phết kính nhuộm Gram lại tìm thấy trực khuẩn Gram (-) thì đó là trực khuẩn E.coli. 6.4.3.3. Xác định vi khuẩn kị khí sinh H2S Xem phần xác định vi khuẩn kị khí sinh H2S chương 5. 6.4.3.4 Xác định trực khuẩn hiếu khí sinh H2S Xem phần xác định trực khuản hiếu khí sinh H2S chương 5. 6.4.3.5. Xác định Vibrio parahaemolyticus Áp dụng đối với nước chấm có nguồn gốc động vật Nguyên tắc: một lượng mẫu nước chấm xác định được tăng sinh trong môi trường chọn lọc đặc trưng Colistine. Cấy phân lập từ môi trường tăng sinh chọn lọc sang môi trường phân biệt chọn lọc đặc trưng Thạch Thiosulphate Citrate Bile salt Sucrose. Cấy các khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường phân lập được khẳng định bằng các thử nghiệm sinh hóa và huyết thanh học. 6.4.3.6. Xác định tổng số nấm men, nấm mốc (xem chi tiết ở chương 5). Áp dụng đối với nước chấm có nguồn gốc thực vật Nhận định kết quả: Nước chấm bán ra thị trường về mặt vi sinh vật phải đáp ứng những yêu cầu sau: - Tổng số vi khuẩn hiếu khí không được quá 5000/ml - Không được có E.coli. - Vi khuẩn kị Khí sinh H2S không được quá 1/ml. - Trực khuẩn hiếu khí sinh H2S không được quá 10/ml. - Không đươc có vi khuẩn gây bệnh. 6.5. Rượu, bia, nước ngọt 6.5.1. Bia 6.5.1.1. Phương pháp lấy mẫu Cứ 1000 chai bia cùng loại, lấy 20 chai ở các ket khác nhau. Mẫu này được dùng làm mẫu phân tích. 6.5.1.2. Xác định trạng thái cảm quan - Bia có màu vàng nhạt, hay vàng rơm đẹp, trong suốt, không có vẫn đục, không có cặn hay vật thể nhỏ, khi đổ vào cốc. Bọt rất mịn, dày, bọt nổi đều liên kết, bọt trắng, kết dính bền tốt. - Mùi thơm, có mùi hoa húp-lông và malt tinh khiết đặc trưng dễ chịu, hòa hợp. Không được có mùi men, mùi chua. - Vị ngọt dịu, vị đắng của hoa húp-lông và malt dễ chịu, hòa hợp không khé cổ, không có các vị lạ khác
- 103. 104 6.5.1.3. Xác địnhchỉ số lý hóa * Xác định tỷ trọng Dùng tỷ trọng kế ở 200 C, chia vạch cách nhau 0,005. Mẫu thử đã được trộn đều và hạ nhiệt độ đến 16-170 C, được đổ vào ống đong từ từ và cho chảy theo đường ống, tránh sủi bọt, cho tới ¾ dung tích. Cho tỷ trọng kế thật nhẹ nhàng vào ống đong, tránh chạm vào thành ống, bỏ tay ra thật nhẹ nhàng. Chú ý tránh để tỷ trọng kế chìm xuống dưới rồi lại nổi lên, làm sai kết quả. Đọc kết quả trên tỷ trọng kế và đọc luôn cả nhiệt độ. Đọc kết quả: - Nếu nhiệt độ đúng +200 C, kết qủa đọc được là kết quả kiểm nghiệm. - Nếu nhiệt độ cao hơn +200 C, thì mỗi độ cao hơn, phải cộng thêm vào kết quả 0,0002. Nếu nhiệt độ thấp hơn +200 C thì phải trừ vào kết quả 0,0002. Tỷ trọng của bia từ 1,005 đến 1,020 * Xác định độ khô Lấy 10ml bia đã loại bỏ CO2, cô khô ở nồi cách thủy, rồi tiến hàn theo phương pháp sấy khô đến trọng lượng không đổi. Độ khô của bia trung bình khoảng 40g/l. * Xác định độ màu Độ màu của bia được xác định theo một trong hai phương pháp: Phương pháp quang phổ: ` - Đo độ hấp thụ của bia ở bước sóng 430nm. Màu dịch đường được tính theo đơn vị EBC bằng độ hấp thụ nhân với hệ số pha loãng. Phương pháp chuẩn độ Iod: Lấy 150ml đến 200ml bia cho vào bình tam giác lắc ở nhiệt độ 17-200 C cho đến khi ngừng tách khí. Lọc qua giấy lọc đã biết trước trọng lượng khô. Dùng ống đong cho vào cốc thủy tinh 100ml nước cất và một cốc khác 100ml bia. Để 2 cốc trên nền đá trắng, quan sát màu từ trên xuống. Dùng micropipet nhỏ thật từ từ dung dịch I2 0,1N vào cốc nước cất, vừa nhỏ vừa dùng đũa thủy tinh khuấy đều cho đến khi màu của dung dịch trong 2 cốc như nhau. Độ màu được tính bằng số ml dung dịch I2 0,1N đã thêm vào dung dịch nước cất. Đây là cách biểu thị độ màu theo thang điểm Brand. Bia vàng: tương ứng 0,6-1,0 ml I2 0,1N Bia nâu : tương ứng 1,0-1,25 ml I2 0,1N Bia đen : tương ứng 4-8 ml I2 0,1N Để chuyển đổi đơn vị màu theo số ml I2 0,1N và độ màu theo đơn vị EBC có thể sử dụng công thức sau: 1 2 3 4 Hình 6.1. Thiết bị đo áp lực CO2 1. Giá đỡ 2. Vít xoắn 3. Đầu nhọn của áp kế 4. Áp kế
- 104. 105 Độ màu tínhtheo ml I2 0,1N = 2 36 EBC 18 EBC ⎟ ⎠ ⎞ ⎜ ⎝ ⎛ × * Xác định độ chua Xác định độ chua trên 10ml bia đã loại bỏ CO2 theo phương pháp trung hòa với phenolphtalein làm chỉ thị. Thông thường độ chua của bia từ 3-4. * Xác định hàm lượng CO2 Phương pháp áp lực Nguyên tắc Đo áp suất khí trong cổ chai bia, kết quả đo được thể hiện trên áp kế. Tại nhiệt độ xác định, áp suất sẽ tỷ lệ với nồng độ CO2. Dụng cụ: - Dụng cụ đo áp lực như hình vẽ - Bình cách thủy - Nhiệt kế Tiến hành Trước khi xác định hàm lượng CO2, chai bia cần đượclàm lạnh hoặc làm ấm đến 25 ± 0,50 C. Vì vậy cần nhúng chai bia lạnh vào bình cách thủy ở nhiệt độ 250 C trong 1h. Sau đó lấy ra lau khô bên ngoài chai. Đặt chai bia vào giá (1). Tiếp đến vặn vít (2) để nâng đầu chai lên, khi nút chai gần tiếp xúc với đuôi áp kế (3), điều chỉnh đuôi áp kế cắm thẳng vào giữa nút chai. Sau đó, vặn vít và nâng chai cho nút chạm vào đuôi áp kế, cao su bọc đuôi áp kế sẽ bị nén và do đó đuôi nhọn của áp kế sẽ chọc thủng nút chai và áp lực CO2 sẽ được biểu thị trên áp kế. Đánh dấu mức bia trong chai, sau đó rót bia ra cốc tráng sạch rồi đổ nước tới ngấn đã đánh dấu. Tiếp theo dùng pipet hay rót thêm nước đến đầy tràn như ban đầu. Lượng nước cho thêm vào chính là thể tích CO2 và cả không khí chiếm trong chai (tính theo ml). Kết quả Hàm lượng CO2 được tính theo công thức sau: CO2 = (P + 1).(X + A) Trong đó: P : chỉ số đọc trên áp kế X : hằng số hòa tan của CO2 trong bia A : hệ số phụ thuộc CO2 chiếm trong chai * Xác định hàm lượng etanol Hàm lượng cồn trong bia được xác định bằng cách chưng cất bia, xác định tỉ trọng ở 200 C của dịch cất. Từ tỷ trọng của dịch cất có thể xác định hàm lượng cồn bằng cách tra bảng độ rượu (%v/v) theo tỷ trọng của dung dịch etanol ở 200 C. Hàm lượng cồn của dịch cất chính là hàm lượng cồn của bia. Để xác định tỷ trọng dùng tỉ trọng kế. 6.5.1.4. Kiểm tra vi sinh vật
- 105. 106 * Xác địnhtổng số vi sinh vật hiếu khí Đối với bia đóng chai thì pha loãng thành các đậm độ 1/10, 1/100, 1/1000. Đối với bia đựng trong thùng thì pha loãng thành các đậm độ 1/10, 1/100, 1/1000. Lấy mỗi đậm độ trên cho vào 3 hộp lồng, mỗi hộp 1ml. Đổ thêm 15ml thạch glucoza 1% đã chảy, để nguội 450 C, sau khi thạch đông đem để vào tủ ấm 370 C. đọc kết quả sau 24 – 48h. Cách đọc và tính kết quả giống ở chương 5. * Tìm tế bào nấm men còn sống sót Phương pháp trực tiếp Đem 100ml bia ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút, lấy cặn phết kính nhuộm đơn và soi kính. Với phương pháp này việc phân biệt tế bào nấm men còn sống và đã chết đòi hỏi phải lành nghề. Phương pháp gián tiếp Nuôi cấy là phương pháp thông dụng nhất. Dùng 3 hộp lồng. Mỗi hộp cho 1ml bia, sau đó đổ môi trường Sabouraud đã điều chỉnh pH về 4,5 – 5,5, để ở nhiệt độ phòng, sau 24 – 48 giờ, đếm số khuẩn lạc nấm men và tính số trung bình như đã áp dụng để đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí. * Xác định E. Coli Dùng phương pháp Vincent Cách tiến hành: Trên mỗi ống Vincent đặc, cho vào mỗi ống 0,34ml dung dịch acid phenic 5% và cấy vào mỗi ống 10ml bia. Trên 3 ống Vincent loãng, cho vào mỗi ống 0,17ml dung dịch acid phenic 5% và cấy vào mỗi ống 10ml bia với nồng độ như sau: + ống 1: 1ml bia nguyên chất + ống 2: 1ml bia pha loãng 1/10 + ống 3: 1ml bia pha loãng 1/100 Cấy xong, lắc đều ống Vincent và để vào tủ ấm 420 C, trong 24-48 giờ. Cứ mỗi môi trường trên bị đục là phải cấy chuyển sang canh thang lactozơ có ống Durham và sang dung dịch pepton. Để vào tủ ấm 420 C, trong 24-48 giờ rồi tìm phản ứng Indol như ở chương 5. Nếu có phản ứng Indol, đồng thời môi trường lactozơ bị đục và sinh hơi thì coi là có E. Coli. Mỗi ống Vincent đặc được coi là có 20 E. Coli, còn ống Vincent loãng thì tính theo độ pha loãng của dịch mẫu cấy vào: Dịch cấy vào không pha loãng mà dương tính được coi là có 1000 E. Coli. Dịch cấy vào pha loãng 1/10 mà dương tính được coi là có 10.000 E. Coli. Dịch cấy vào pha loãng 1/100 mà dương tính được coi là có 100.000 E.Coli. * Xác định Clostridium Welchii Cách chuẩn bị và tiến hành như chương 4, 5.
- 106. 107 Tính kết quả:Chia số khuẩn lạc đếm được cho 10 và nhân với 1000 để biết số vi khuẩn có trong 1 lít bia. * Xác định vi khuẩn gây bệnh: chủ yếu là tìm tụ cầu vàng Cấy 1ml bia vào canh thang glucozơ 1%, để vào tủ ấm 370 C, trong 24giờ. Cấy chuyền sang môi trường Chapman, nếu tìm thấy cầu tụ thì tìm tính chất đông huyết tương của tụ cầu. Nhận định kết quả: Đối với bia đóng chai đã được tiệt khuẩn theo phương pháp Pasteur: - Tổng số vi khuẩn hiếu khí không được quá 100/lít. - Không được có vi khuẩn gây bệnh, Clostridium Welchii, E. Coli. - Không được có nấm men. Đối với bia hơi bán lẻ: - Tổng số vi khuẩn hiếu khí không được quá 100/lít. - Không được có vi khuẩn gây bệnh, Clostridium Welchii, E. Coli. - Không được có nấm men. - Tế bào nấm men không được quá 20. 6.5.2. Rượu 6.5.2.1. Rượu trắng * Xác định trạng thái cảm quan Xác định màu sắc, độ trong Dùng 2 ống so màu có độ đường kính và chiều dài bằng nhau. Rót 20ml rượu trắng vào một ống nghiệm, 20ml nước cất vào ống nghiệm kia, đặt 2 ống nghiệm trên nền trắng ở chỗ sáng để so sánh màu sắc, độ trong. Màu sắc, độ trong của 2 ống phải như nhau. * Xác định chỉ số lý hóa Xác định độ rượu Dùng tỷ trọng kế: xem phần bia Dùng bình tỷ trọng: - Bình tỷ trọng có nhều loại khác nhau nhưng đều dựa trên nguyên tắc so sánh khối lượng của chất lỏng với nước cất cùng thể tích. - Để đo bằng bình tỷ trọng, đầu tiên phải rửa bình thật sạch, sấy khô và làm sạch trong bình hút ẩm, sau đó đem cân bình không ta thu được a gam. - Tiếp theo rót nước cất vào bình đến trên ngấn định mức, đặt vào nồi cách thủy, có nhiệt độ 200 C. Sau 15 phút, dùng giấy lọc thấm nước đến ngấn bình đồng thời thấm khô phần không chứa nước, lau khô nước và đậy lại. Lấy bình ra khỏi nồi điều nhiệt, lau khô phía ngoài bình đem cân được b gam. Tiếp theo đổ nước khỏi bình, tráng bình từ 2 đến 3 lần bằng dung dịch cân đo tỷ trọng rồi cùng rót chất lỏng tới vạch, sau đó làm tương tự như khi bình chứa nước, giả sử bình chứa dịch cân được c gam. Chú ý: Sau khi định mức chất lỏng ở 200 C vừa tới ngấn, nhiệt độ sẽ tăng và mức chất lỏng sẽ cao hơn ngấn cũ. Điều này không làm ảnh hưởng đến kết quả.
- 107. 108 Tỷ trọng chấtlỏng so với nước cùng nhiệt độ 200 C sẽ là: a b a c d20 20 − − = Căn cứ vào tỷ trọng tra Phụ lục, ta sẽ biết % rượu trong chất lỏng. Trường hợp khi đo nhiệt độ chất lỏng khác 200 C nhưng biết rõ nhiệt độ khi cân nước vẫn là 200 C, ta có thể chuyển dt sang d20 theo bảng, rồi tiếp đó tra phụ lục để biết nồng độ rượu. Dùng cồn kế: (rượu kế thủy tinh, tửu kế, thước đo độ rượu) - Rót rượu vào ống đong đặt thẳng đứng, ống đong phải sạch, khô, phải tráng qua dung dịch đo. Nhiệt độ khi đo cần làm lạnh hoặc gia nhiệt đến xấp xỉ 200 C. - Từ từ nhúng cồn kế vào, buông tay để cồn kế nổi tự do, rồi đọc kết quả. Làm 2-3 lần, lấy kết quả trung bình. Khi đọc phải đặt ngang tầm mức chất lỏng, không đọc phần lồi hay phần lõm. Dùng cân tỷ trọng: Cân tỷ trọng cũng dựa trên sức đẩy Archimedes và có cấu tạo như hình. Dung dịch rượu hoặc chất lỏng bất kỳ được rót vào ống đong, sau đó nhúng thỏi thủy tinh được treo trên móc thăng bằng. Chất lỏng sẽ đẩy thỏi thủy tinh một lực m, tùy theo tỷ trọng d của chất lỏng lớn hay bé, cán cân sẽ bị lệch so với thăng bằng với nước cất lúc ban đầu. Bằng cách đặt và thay đổi các quả cân A1, A, B, C, D vào các vị trí sao cho cân trở lại trạng thái cân bằng. Đọc trên cán cân và các vị trí các quả cân ta sẽ có tỷ trọng trực tiếp của chất lỏng ở nhiệt độ t. Khi treo A1 vào để cân các chất có d 1, còn đối với rượu và các chất lỏng có d 1 thì không cần móc A1 vào. Khi cân thăng bằng với nước cất cần tiến hành ở nhiệt độ 200 C, còn với dung dịch có thể đo ở nhiệt độ 200 C, rồi cũng hiệu chỉnh theo bảng và sau đó làm tương tự như khi xác định tỷ trọng bằng bình tỷ trọng kể trên. Xác định hàm lượng acid Dùng pipet hút 5ml rượu mẫu vào bình tam giác 250ml, cho thêm 15-20ml nước cất để sau đó dễ nhận màu. Cho vào vài giọt phenolphtalein và dùng NaOH 0,1N để chuẩn cho đến khi có màu phớt hồng. Kết quả: Hàm lượng acid (theo acid axetic) ) l / mg ( 1000 . V 1000 . V . 006 , 0 Acid 1 = Trong đó: V1 : Thể tích dd NaOH 0,1N đã dùng, ml V : Thể tích rượu đem dùng, ml 0,006 : Hệ số tương ứng với acid axetic Xác định hàm lượng Este Nguyên tắc Hàm lượng este được xác định dựa vào phản ứng xà phòng hóa: CH3COOC2H5 + NaOH → CH3COONa + C2H5OH
- 108. 109 Tiến hành - Chovào bình cầu 50ml rượu đã trung hòa acid, 50ml nước cất và 10ml dung dịch NaOH 0,1N. - Lắp hệ thống nước làm mát, bật điện. - Đun dung dịch trong bình cầu ở nhiệt độ 80 – 1000 C, thời gian 1h. - Rút điện, tắt nước làm mát, làm nguội bình cầu. - Hút chính xác 10ml H2SO4 0,1N cho vào bình cầu, 1-2 giọt phenolphtalein (P.P). - Chuẩn độ dung dịch trong bình tam giác bằng dung dịch NaOH 0,1N đến khi dung dịch chuyển sang màu hồng thì ngừng. Ghi thể tích dung dịch NaOH tiêu tốn. Tính kết quả Hàm lượng este (theo este acetat) ) / ( 1000 . 1000 . . 0088 , 0 1 l mg V V Este = Trong đó: V1 : Thể tích dd NaOH 0,1N đã dùng, ml V : Thể tích rượu đem dùng, ml 0,0088 : Hệ số quy về etyl acetat Xác định hàm lượng Aldehyt Nguyên tắc Hàm lượng aldehyt được xác định dựa vào phương pháp Iod CH3CHO + NaHSO3 → CH3CH(OH)NaSO3 NaHSO3 + I2 + H2O ⎯ ⎯→ ⎯HCl NaHSO4 + 2HI + NaHCO3 CH3CH(OH)NaSO3 ⎯ ⎯ ⎯ → ⎯ 3 NaHCO CH3CHO + NaHSO3 NaHSO3 + I2 + H2O → NaHSO4 + 2HI Tiến hành Lấy 50ml rượu cho vào bình nón 250ml, thêm 25 ml NaHSO3 1,2%, lắc đều và để 1h. Sau đó cho vào 5-7ml dd HCl 1N và dùng dung dịch I2 0,1N để oxy hóa lượng NaHSO3 dư với chỉ thị là dung dịch tinh bột 0,5%. Tiếp đến, thêm vào bình 25ml NaHCO3 để giả phóng lượng NaHSO3 và aldehyt. Sau 1 phút, dùng dung dịch I2 0,01N để chuẩn lượng NaHSO3 vùa được giải phóng do kết hợp với aldehyt lúc ban đầu. Phản ứng được xem là kết thúc khi xuất hiện màu tím nhạt. Song song đó làm một thí nghiệm trắng để kiểm chứng, thay 50ml rượu bằng 50ml nước cất. * Tính kết quả Hàm lượng aldehyt được xác định theo công thức: ) / ( 1000 . 22 , 0 ). ( 0 1 2 l mg V V V Aldehyt − = Trong đó: V2 : Thể tích dd I2 0,01N đã dùng trong thí nghiệm thực, ml V1 : Thể tích dd I2 0,01N đã dùng trong thí nghiệm kiểm chứng, ml
- 109. 110 0,22 : Sốml aldehut acetic tương ứng với 1ml dung dịch I2 0,01N 6.5.2.2. Rượu mùi * Xác định trạng thái cảm quan Xác định màu sắc, độ trong Lấy 100ml rượu mùi cho vào cốc thuỷ tinh không màu dung tích 150ml. Đem quan sát màu của rượu mùi và sự vẫn đục của rượu trong ánh sáng thường, trên nền trắng. Xác định mùi vị: giống như phần rượu trắng * Xác định chỉ số lý hóa Xác định độ rượu Mỗi loại rượu mùi khác nhau đều có một độ rượu khác nhau, khi xuất ra phải đúng độ rượu quy định và quy định chung chỉ sai số 10 mà thôi. Việc phân tích độ rượu chính xác sẽ đảm bảo cho việc quyết định sản xuất và hợp đồng thương mại. Tiến hành: - Cho chính xác 200ml rượu mẫu vào bình cầu dung tích 500ml, cho thêm đúng 100ml nước cất rồi lắp vào ống sinh hàn đặt lên bếp cất. - Chú ý không nên đun quá sôi mà cho rượu sôi nhẹ đều, muốn vậy không nên đặt bình trực tiếp mà nên đặt cao lên một chút hoặc trên một lớp đệm amiăng. Nếu bếp có bộ điều chỉnh nhiệt thì tốt. Ở dưới ống sinh hàn hứng rượu ra bằng một bình có dung tích 250ml, cho vào bình một ít nước cất trước, mục đích là để rượu cất ra sẽ bay hơi vì bao giờ đợt đầu rượu bốc ra sẽ cao độ. - Lấy ra 190ml và thêm nước vào cho đủ 200ml. Lắc đều dùng thước đo cồn và nhiệt kế cồn đo rồi dùng bảng tra đọc kết quả. Xác định hàm lượng acid Giống như phần rượu trắng Kết quả: Hàm lượng acid (theo acid acetic) ) l / mg ( 1000 . V 1000 . V . 0064 , 0 X 1 = Trong đó: V1 : Thể tích dd NaOH 0,1N đã dùng, ml V : Thể tích rượu đem dùng, ml 0,0064 : Hệ số tương ứng với acid acetic Xác định hàm lượng saccharose Tiến hành: - Lấy chính xác 10ml rượu mẫu vào bình tam giác dung tích 250ml, cho thêm đúng 30ml nước cất rồi đun trên bếp điện 10 phút để bay hết hơi rượu. Cho thêm 8ml HCl 5%, lắc đều rồi đặt trên bếp cách thủy 800 C trong 5 phút.
- 110. 111 - Làm nguộibình tam giác đến nhiệt độ phòng, thêm 4-5 giot P.P, dùng NaOH 20% để trung hòa hết axit đến khi gần chuyển màu thì dùng NaOH 0,1N chuẩn cho đến khi dung dịch chuyển sang màu phớt hồng thì dừng. - Chuyển toàn bộ dung dịch sang bình định mức dung tích 250ml, dùng nước cất tráng bình tam giác rồi chuyển sang bình định mức (2-3 lần). Thêm nước cất đến vạch. - Tiến hành xác định hàm lượng đường khử trong bình định mức bằng phương pháp Bertrand (hoặc phương pháp metylen xanh). Tính kết quả Hàm lượng đường có trong mẫu thử Đ = 4 KMnO V .6,36 (mg) Hàm lượng đường tính bằng g/l rượu mẫu: 95 , 0 . 100 . 1000 . 5 1000 . 250 . a X = (g/l) Trong đó: 6,36 : Số mg đường tương ứng với 1ml dung dịch KMnO4 0,1N a: Số ml đường được tra bảng theo phương pháp Bertrand 250 : Dung tích bình định mức. 1000 : Chuyển ra lít. 0,95 : Hệ số chuyển đổi ra đường Saccharose 5: Dung tích mẫu hút xác định bằng phương pháp Bertrand (ml) 1000 : Chuyển ra gam. 100 : Dung tích rượu lấy ban đầu (ml) Định tính Saccharin - Saccharin là hợp chất amit của acid octo-sunfuabenzoic. - Công thức: - Saccharin có độ ngọt gấp 500 lần đường Saccharose. Cách định tính: - Cách 1: Lấy 20ml mẫu vào cốc đun, thêm 5ml H2SO4 đậm đặc (hay HCl đậm đặc), đun nóng trên bếp điện. Nếu thấy phát hiện có mùi phenol bay ra là chứng tỏ có Saccharin. - Cách 2: Về mặt thử cảm quan, cảm giác ngọt của đường Saccarozơ đến mau hơn và chóng hết hơn, còn đường Saccharin thì đến chậm hơn và dư vị ngọt lâu hơn. Xác định phẩm màu Nguyên tắc: Từ dung dịch phẩm màu chiết xuất được từ mẫu thử. Dùng phương pháp sắc ký giấy tách các phẩm màu và so sánh với các sản phẩm màu chuẩn đã có, có thể định CO S NH O O
- 111. 112 tính được chúng.Để tách được phẩm màu từ thực phẩm có thể dùng phương pháp nhuộm len hoặc chiết bằng dung môi. Dụng cụ thiết bị, nguyên liệu, hóa chất - Micropipet chia đến μl hoặc ống mao quản. - Bình chứa dung môi chạy sắc kí giấy. - Giấy sắc kí. - Các dung dịch phẩm màu để so sanh (đã biết hàm lượng màu). - Các hệ dung môi chạy sắc kí (tùy theo loại phẩm màu đã chọn hệ dung môi phù hợp). +Hệ dung môi 1: trinatri citrat-amoniac-nước 2:5:93 +Hệ dung môi 2: etanol-amoniac-nước 2,5:2,5:85 +Hệ dung môi 3: n.butanol-etanol-nước 2:1:1 +Hệ dung môi 4: phenol-etanol-nước 8:5:8 +Hệ dung môi 5: phenol-nước-amoniac 8:2:1 +Hệ dung môi 6: piridin-isobutanol-nước 8:6:3 +Hệ dung môi 7: etyl acetat-piridin-nước 50:25:20 Tiến hành: Bước 1: Chọn sắc ký giấy Cần phải chọn kích thước của giấy sắc ký sao cho đường kính (sau khi đã cuộn thành hình trụ) nhỏ hơn từ 2 - 3 cm so với đường kính của bình chứa dung môi chạy sắc ký, chiều cao của cuộn giấy thấp hơn chiều cao của bình ít nhất là 5cm, nhưng không thấp hơn 35cm. Phía cuối của giấy sắc ký, cách mép giấy khoảng 3cm, kẻ một đường thẳng bút chì, chia đường đó thành những đoạn bằng nhau, cách nhau 2 - 3 cm, hai đầu cách mép giấy 2 - 3 cm. Bước 2: Chuẩn bị bình sắc ký Bình thủy tinh có nắp đậy kín được, kích thước của bình phụ thuộc vào kích thước của giấy. Nếu các chất của giá trị Rf gần bằng nhau thì cần giấy dài hơn nên bình phải cao. Chiều cao của bình thường là 40 - 50 cm, còn chiều rộng của bình thường là 20cm để có thể làm nhiều mẫu cùng một lúc. Đổ dung môi vào bình sắc ký một lớp dày 15mm, sau đó đậy nắp bình. Sau 2 giờ tạo được một trạng thái bão hòa hơi dung môi trong bình. Bước 3: Chấm mẫu thử lên giấy Chấm trên cùng đường thẳng đã chia ở trên 2 chấm dung dịch cần thử, xen kẽ vào giữa là những chấm dung dịch phẩm màu chuẩn. Lượng dung dịch hút để chấm lên giấy sao cho xuất hiện những vết có đường kính 2 - 4cm. Chú ý chấm những chấm nhỏ để khô, rồi chấm tiếp giọt sau để đảm bảo vết chấm cuối cùng có đường kính nhỏ nhưng chứa được đủ thể tích yêu cầu và chú ý lượng dung dịch mẫu thử và lượng dung dịch phẩm màu chuẩn phải gần tương đương nhau. Sau khi các vết chấm đã khô, cố định giấy sắc ký (cuộn lại thành hình trụ) sao cho 2 mép giấy còn cách xa nhau một khoảng là 1cm. Trường hợp các vết chấm trên giấy chưa khô hoàn toàn thì có thể dùng
- 112. 113 máy sấy tóchoặc để ra ngoài không khí 1h để độ ẩm các điểm trên giấy trở nên như nhau. Cho chạy dung môi và phát hiện vết: Đặt cuộn giấy vào bình sắc ký đã chuẩn bị trước, chú ý đừng để chạm vào thành bình. Trong thời gian này dung môi lan truyền từ từ trên giấy. Việc chạy sắc ký hoàn toàn khi đường mức của dung môi đã truyền gần tới đầu phía đối lập của tờ giấy khoảng 25cm. Thời gian cần thiết khoảng 1-12 h phụ thuộc vào từng loại phẩm màu và từng hệ dung môi. Kết thúc quá trình sắc ký, lấy cuộn giấy ra. Vạch vị trí của đường mức dung môi và làm khô trong tủ hút. Sau khi giấy khô có thể đọc được kết quả bằng mắt hoặc soi ở ánh sáng đèn tử ngoại. Để tính giá trị Rf của các phẩm màu đã được phân chia, đánh dấu vị trí trung bình của các vết và đường mức dung môi, rồi đo khoảng cách từ đó đến đường xuất phát. Nếu ký hiệu a: khoảng cách từ đường xuất phát tới tâm của vết chấm đã được phân chia. Và b: khoảng cách từ đường xuất phát tới mức của dung môi. Thì giá trị Rf được tính bằng công thức sau: Rf = b a Đánh giá kết quả sắc ký đồ: Giá trị tuyệt đối của Rf rất khó xác định vì phải làm trong những điều kiện thật giống nhau. Tuy vậy, có thể định tính bằng cách làm sắc ký so sánh với một chất phẩm màu chuẩn (Bảng 6.1). Sau khi chạy sắc ký, ta so sánh vị trí của các vết (mẫu thử và phẩm màu chuẩn). Nếu ta thu được: − Màu của các vết giống nhau. − Giá trị Rf gần giống nhau. Sau khi làm sắc ký ít nhất với hai hệ dung môi thì có thể kết luận là hai chất như nhau. Bảng 6.1. Định tính các phẩm màu. Phù hợp Phẩm màu và hỗn hợp phẩm màu để so sánh Nồng độ phẩm màu Hệ dung môi Phẩm vàng: Tartrazine CI.19140 0,2 1,2,3,6 Phẩm vàng acid: Fast yellow AB CI. 13015 0,3 1,2,3,6 Phẩm đỏ: Fonceou 4R CI. 16225 0,2 1,2,3 Phẩm đỏ: Amoranth CI. 16185 0,2 1 Phẩm đỏ: Erithrosine CI. 45430 0,1 3,4 Phẩm xanh: Indigocarmine CI. 73015 0,1 3,5,6,7 Phẩm đen: Brilliant black CI. 28440 0,2 3,6 Tartrazine ponceau 4R 0,4 1 Tartrazine Indigocarmin 4R 0,4 5
- 113. 114 Tartrazine + Ponceau4R + Brilliant black 0,6 Tartrazine + Amoranth + Indigocarmin 0,6 Tartrazine + Amoranth + Brilliant black 0,6 Phẩm màu vàng mặt trời: Sunset yellow FCH CI. 15985 0,2 1,2,3,6 6.5.3. Nước giải khát nhân tạo Nước giải khát nhân tạo được pha chế từ nước đường với acid hữu cơ, tính dầu thực phẩm, nén khí CO2, có hoặc không có pha thêm màu thực phẩm. 6.5.3.1. Xác định trạng thái cảm quan Một mẫu nước giải khát tốt nếu trong suốt, không có vẩn đục, không có cặn hay vật thể nhỏ, màu nhạt. Mùi vị êm dịu, ngọt mát, hơi chua, có vị tê lưỡi của khí CO2. 6.5.3.2. Xác định các chỉ số lý hóa * Xác định độ chua: giống phần rượu mùi * Xác định hàm lượng đường tổng số Xác định đường tổng số theo phương pháp Betrand, sau khi thủy phân mẫu thử 700 C trong 7 phút (xem phương pháp Betrand ở chương 3). * Xác định hàm lượng CO2: Xác định hàm lượng CO2 theo phương pháp áp lực (xem chi tiết ở phần xác định CO2 của bia). * Định tính saccarin (giống phần rượu mùi) * Xác định phần màu (giống phần rượu mùi) 6.5.3.3. Xác định các chỉ số vi sinh (giống phần rượu mùi) Đối với các nước giải khát bán lẻ thì kiểm nghiệm ngay, còn nước giải khát đóng chai phải loại bỏ CO2 rồi mới kiểm nghiệm. Các chỉ tiêu vi sinh cần xác định bao gồm: − Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí. - Xác định tổng số nấm men, nấm mốc. − Xác định E.Coli. - Xác định vi khuẩn gây bệnh. − Xác định Clostridium Welchii. Nhận định kết quả: Đối với nước giải khát nhân tạo bán lẻ: − Tổng số vi khuẩn hiếu khí không được quá 5000/lít. − Không được có vi khuẩn gây bệnh, Clostridium Welchii. − Chỉ số E.Coli chỉ được phép 20. - Tế bào nấm men không được quá 20. Đối với nước giải khát nhân tạo đóng chai − Tổng số vi khuẩn hiếu khí không được quá 5000/lít. − Không được có vi khuẩn gây bệnh, Clostridium Welchii, E.Coli. − Không được có nấm men, nấm mốc. Không được có vi khuẩn gây bệnh, Clostridium Welchii.
- 114. 115 TÀI LIỆU THAMKHẢO 1.Hoàng Minh Châu (2002), Cơ sở hóa học phân tích – NXB KHKT, Hà Nội, 2002. 2.Bộ y tế Vụ khoa học và đào tạo(2007), Kiểm nghiệm dược phẩm, Nhà xuất bản y học 3.Nguyễn Lân Dũng và cộng sự(1997), Vi sinh vật học, Hà Nội 4.Từ Vọng Nghi (2000), Hóa học phân tích - NXB ĐHQG Hà Nội, 2000. 5.Phạm Luận(1994), Cơ sở lý thuyết hóa phân tích, ĐHTHQG Hà Nội 6.Phạm Luận(1999), Những vấn đề cơ sở của các kỹ thuật xử lý mẫu phân tích, ĐHTHQG Hà Nội 7. Nguyễn Thị Hiền, Từ Việt Phú, Trần Thanh Đại(2009), Phân tích thực phẩm, Nhà xuất bản trường cao đẳng kỹ thuật- công nghệ Đồng Nai 8. Nguyễn Thị Mận(1998), Phân tích thực phẩm, Trường cao đẳng lương thực thực phẩm Đà Nẵng. 9.Phạm Hải Tùng, Phạm Gia Huệ(1987), Hóa học phân tích, NXB Yhọc, Hà Nội. 10.Skoog D.A.-west D.M. West, HollerF.J(1988), Fundamentals of Analytical Chemistry 5th , ed. Saundes colleeg Publíhing. P.p.557-598