Downloaded 366 times
More Related Content
Similar to Laporan sterilisasi, pembuatan media, dan teknik inokulasi
![Knowledge Management: Konsep dan Metodologi]](https://cdn.slidesharecdn.com/ss_thumbnails/riviewjurnaldara-251121154528-aec8dd51-thumbnail.jpg?width=640&height=640&fit=bounds)
Laporan sterilisasi, pembuatan media, dan teknik inokulasi
- 1. LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI UJIANGKA PALING MUNGKIN (MPN) BAKTERI COLIFORM ANGGOTA DIAN KHAIRUNNISA (171501157) IRNANDA LESTARI (171501137) MUHAMMAD MULIANDI BANDASO (171501014) SRI WAHYUNI (171501175) KELOMPOK/HARI : 1 / SELASA TGl PERCOBAAN : 20 FEBRUARI 2018 ASISTEN : ALDO JOSUA SIMANJORANG LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SUMATERA UTARA MEDAN 2018
- 2. BAB I PENDAHULUAN 1.1 LatarBelakang Peralatan dan bahan yang dipergunakan dalam bidang mikrobiologi harus dalam keadaan steril. Steril artinya tidak didapatkan mikroba yang tidak diharapkan kehadirannya, baik yang mengganggu atau merusak media atau mengganggu kehidupan dan proses yang sedang dikerjakan (Waluyo, 2010). Untuk menelaah bakteri di laboratorium kita harus dapat menumbuhkan mereka dalam biakan murni. Untuk melakukan hal ini haruslah dimengerti jenis- jenis nutrien yang disyaratkan oleh bakteri dan juga macam lingkungan fisik yang menyediakan kondisi optium bagi pertumbuhannya (Waluyo, 2010). Agar suatu mikroorganisme tumbuh, dibutuhkan berbagai unsur kimia sebagai nutrisi. Elemen tersebut diperlukan baik untuk sintetis maupun fungsi normal komponen seluler. Salah satu hal yang harus dilakukan adalah memberikan unsur kimia penting yang tepat. Unsur utama yang diperlukan untuk pertumbuhan sel meliputi karbon, nitrogen, oksigen, belerang dan fosfor (Pelczar, 1993). Unsur-unsur tersebut digunakan oleh sel-sel untuk membentuk blok-blok pembangun dasar molekular (misalnya protein karbohidrat, asam nukelat, lipid). Sel juga memerlukan suatu sumber energi, untuk membantunya menghasilkan tenaga yang diperluka bagi reaksi-reaksi selular (Susan Erlod, 2007). Bakteri yang ditumbuhkan di laboratorium dalam sebuah larutan yang terdiri atas air, nutrien, dan sumber-sumber energi disebut sebagai suatu biakan atau kultur bakteri. Bakteri juga bisa ditumbuhkan dalam suatu kaldu (broth) atau medium kultur cari atau pada medium yang dipadatkan dengan penambahan agar. Inokulasi bakteri ke atas permukaan agar disebut plating (disebar di atas plate). Bakteri yang disebar pada plate kemudian akan berkembang dan tumbuh menjadi kumpulan ribuan sel yang disebut sebagai koloni bakteri (Susan Erlod, 2007). Penyelidikan spesies mikroba selalu didsarkan atas sifat biakan murni spesies tersebut. Biakan murni (pure culture) dibiakkan pada media yang mendukung pertumbuhannya dan dilakukan dalam keadaan steril (Waluyo, 2010).
- 3. 1.2 Prinsip Percobaan 1.2.1Sterilisasi Alat Semua alat dan media akan disterilkan berdasarkan metode sterilisasi yang sesuai berdasarkan kestabilannya terhadap panas yaitu dengan metode panas kering yang berlangsung di oven pada suhu 170°C selama 1 jam dan metode panas basah yang berlangsung di autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit. 1.2.2 Pembuatan Media Sterilisasi dan pembuatan media mikrobiologi diambil dari prosedur literatur ataupun pada label kemasan media yang dipakai. Proses sterilisasi uap menggunakan autuklaf untuk media mikrobiologi dan larutan pengencer umumnya berlangsung selama 15 menit pada suhu 121°C. 1.2.3 Teknik Inokulasi Mikroorganisme diambil menggunakan ose steril kemudian diinokulasi pada media dan selanjutnya diinkubasi pada suhu 35 ± 2°C selama 1 x 24 jam. 1.3 Tujuan Percobaan - Untuk mengetahui metode-metode sterilisasi dan cara mensterilisasikan alat dan bahan media. - Untuk mengetahui cara pembuatan media pertumbuhan mikroorganisme - Untuk mengetahui dan memahami cara menginokulasi mikroorganisme dengan metode gores, tebar, maupun tuang dengan teknik kerja aseptis. 1.4 Manfaat Percobaan - Agar praktikan dapat mengetahui metode-metode sterilisasi dan cara mensterilkan alat dan bahan media. - Agar praktikan dapat mengetahui cara pembuatan media pertumbuhan mikroorganisme. - Agar praktikan dapat mengetahui dan memahami cara menginokulasi mikroorganisme dengan metode gores, tebar, maupun tuang dengan teknik kerja aseptis
- 4. BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1Sterilisasi Peralatan atau bahan yang pergunakan dalam bidang mikrobiologi harus dalam keadaan steril. Steril artinya tidak didapatkan mikroba yang tidak diharapkan kehadirannya, baik yang mengganggu atau merusak media atau mengganggu kehidupan dan proses yang sedang dikerjakan. Setiap proses baik fisika, kimia, dan mekanik yang membunuh semua bentuk hidup terutama mikroorganisme disebut dengan sterilisasi (Waluyo, 2010) Sterilisasi merupakan suatu proses dengan metode tertentu yang dapat memberikan hasil akhir, yaitu suatu bentuk keadaan yang tidak dapat ditunjukkan lagi adanya mikroorganisme hidup. Metode sterilisasi cukup banyak, namun alternatif yang dipilih sangat bergantung pada keadaan serta kebutuhan setempat. Apapun pilihan metodenya, hendaknya tetap menjaga kualitas hasil sterilisasi(Raudah, 2017). Metode sterilisasi yang paling umum digunakan adalah metode panas, baik itu panas kering maupun panas basah, namun kadang-kadang metode lain, seperti penyaringan cairan yang mempertahankan mikroorganisme yang dapat dibudidayakan di media laboratorium biasa, sangat diharapkan (Burrows, 1959). Untuk peralatan gelas seperti labu, cawan Petri, tabung reaksi dan pipet harus dalam keadaan bersih. Labu dan tabung disumbat dengan kapas tidak menyerap yang dapat mencegah masuknya kembali bakteri setelah disterilisasi, dan juga kapas dimasukkan ujung mulut pipet. Cawan Petri dan pipet dapat ditempatkan di dalam kaleng dengan penutup atau dibungkus dengan kertas untuk menjaga sterilitasnya (Burrows, 1959). Sterilisasi dengan panas merupa metode yang relatif efisien, dapat dipercaya, dan relatif tidak mahal. Mikroorganisme dapat tumbuh pada berbagai temperatur, tetapi pertumbuhannya dapat dihambat atau dihentikan bila suhu tumbuhnya diubah. Bila suhu tumbuhnya maksimum dinaikkan, maka akan terjadi perubahan molekul organiknya sehingga mikrobe tersebut akan mati (Waluyo, 2010).
- 5. Prinsip kerja pembunuhankuman dengan panas kering adalah menyebabkan denaturasi protein dan efek toksik akibat kenaikan kadar elektrolit. Cara kerja dari panas tersebut adalah bahwa panas membunuh mikroba karena mendenaturasi protein, terutama enzim-enzim dan membran sel. Panas kering membunuh bakteri karena oksidasi komponen-komponen sel. Cara yang dapat dilakukan adalah dengan pembakaran dan oksidasi (Waluyo, 2010). Teknik pembakaran Iangsung merupakan teknik sterilisasi panas kering yang tercepat dan 100% efektif. Caranya adalah dengan membakar peralatan sampai pijar. Proses ini di Iaboratorium untuk mensterilkan alat penanam bakteri (ose, tugal), mulut tabung reaksi sewaktu membuat kultur, dan lain-Iain. Prosedur ini sangat efektif membunuh bentuk spora maupun toksin yang dihasilkan oleh bakteri. Peralatan Iaboratorium yang dapat disterilkan dengan cara pembakaran Iangsung hanya alat-alat yang terbuat dari logam dan kaca. Teknik ini tidak dapat digunakan untuk mensterilkan bahan-bahan yang terbuat dari karet, plastik, kertas, dan media mikrobiologis (Lud Waluyo, 2010). Sterilisasi panas kering dapat dilakukan di oven dengan udara panas. Bahan yang disterilisasi di dalam oven ditempatkan rapi tanpa berkurumun dan suhu dinaikkan sampai 170°C - 180°C. Suhu tersebut dipertahankan dalam jangka waktu tidak kurang dari 2 jam (Burrows, 1959). Sterilisasi panas basah menggunakan autoklaf merupakan metode sterilisasi palin efisien, dimana alat-alat yang disterilisasi tersebut terkena uap air dengan suhu di atas 100 °C yang dihasilkan saat uap berada di bawah tekanan. Uap dihasilkan langsung di peralatan atau dipasok melalui sambungan ke saluran uap bertekanan tinggi (Burrows, 1959). Teknik sterilisasi pendidihan dengan air akan dapat membunuh mikroorganisme dengan cara mengkoaguiasikan dan mendenaturasi protein sel mikrobe. Proses koagulasi dan denaturasi protein memeriukan energi yang lebih sedikit daripada proses oksidasi. Oleh karena itu, teknik ini memeriukan suhu yang lebih rendah (Waluyo, 2010). Sebelum direbus, alat-alat harus bersih dari segala kotoran, seperti feses dan darah. Alat-alat yang akan disterilkan harus direndam dalam air. Hampir semua bentuk vegetatif sel bakteri akan hancur dalam waktu beberapa detik setelah
- 6. perebusan. Tetapi halini tidak berlaku untuk spora jamur. kista Protozoa, dan beberapa virus seperti virus hepatitis (Waluyo, 2010). Sebenarnya, mikroorganisme biasanya mati dalam beberapa menit pada suhu 80°C. Namun, endospora bakteri memperlihatkan ketahanan yang luar biasa terhadap panas, dan mungkin masih dapat bertahan pada suhu air mendidih sampai 20 jam. Endospora yang sangat resisten biasanya diisolasi dari makanan tempat spora berlindung. Spora jamur lebih mudah dibinasakan daripada endopspora bakteri. Oleh karena itu, kita tidak dapat mempercayai air mendidih untuk mensterilkan secara penuh (Waluyo, 2010). Dari semua metode sterilisasi, sterilisasi panas basah yang berupa uap jenuh di bawah tekanan aadalah sterilisasi yang paling banyak digunakan dan paling bisa diandalkan. Sterilisasi dengan panas basah tidak beracun, tidak mahal, dan cepat membunuh mikroba. Prinsip dasar dari sterilisasi panas basah, seperti yang dilakukan di dalam autoklaf, adalah untuk mengekspos setiap alat dan bahan kontak dengan uap langsung pada suhu dan tekanan yang ditentukan (Rutala dan David, 2008) Ada empat parameter sterilisasi panas basah: uap, tekanan, suhu dan waktu kontak. Uap idela untuk sterilisasi adalah uap jenuh kering dan air entrained (fraksi kekeringan ≥97%). Tekanan berfungsi sebagai sarana untuk mendapatkan suhu yang tinggi yang diperlukan untuk membnuh mikroorganisme dengan cepat. Suhu spesifik harus diperoleh untuk memastikan aktivitas mikroba. Dua temperatur yang umum digunakan sterilisasi panas basah adalah 121°C dan 132°C. Temperatur ini (dan suhu tinggi lainnya) harus dipertahankan untuk waktu minimal untuk membunuh mikrooganisme. Pada suhu konstan, waktu sterilisasi bervariasi tergantung pada jenis item (logam atau karet, plastik), apakah item tersebut dibungkus atau tidak, dan jenis alat sterilisasinya (Rutala dan David, 2008). Selain itu, pada sterilisasi bahan ataupun material, lamanya waktu yang diperlukan juga bergantung pada volume material dari yang disterillisasi. Misalnya untuk material volume yang kecil, yang diletakkan di dalam tabung kultur, hanya memerlukan waktu ±15 menit, sedangkan untuk volume yang lebih
- 7. besar, seperti didalam labu, diperlukan pemaparan yang lebih lama (Burrows, 1959). Prinsip kerja autoklaf, ketika molekul air menjadi panas, maka daya penetrasinya menjadi bertambah. Dalam autoklaf, yang mensterilkannya adalah panas basah, bukan pada tekanannya. Oleh karena itu, setelah air di dalam tangki mendidih dan mulai terbentuk uap air, maka uap air ini akan mengalir ke ruang pensteril guna mendesak keluar semua udara di dalamnya. Bila masih ada udara yang tersisa, maka udara ini akan menambah tekanan di dalam ruang pensteril yang akan mengganggu naiknya suhu dalam ruang tersebut (Waluyo, 2010). Alat-alat dan bahan yang akan disterilkan lebih baik ditempatkan dalam beberapa botol yang agak kecil daripada dikumpulkan dalam satu botol yang besar. Setelah pintu otokiaf ditutup rapat, barulah kran pada pipa uap dibuka, dan temperatur akan terus. menerus naik sampai 121°C. Biasanya otoklaf sudah diatur sedemikian rupa, sehingga pada suhu tersebut, tekanan yang ada 1 atmosfer per 1 cm3. Penghitungan waktu 15 atau 20 menit dimulai semenjak termometer pada otokIaf menunjuk 121°C. Otoklaf tidak boleh dibuka langsung segera setelah proses sterilisasi selesai, agar isi botol yang ada dalam otoklaf tidak meluap ke mana-mana. Sebaiknya kita menunggu sampai manometer menunjukkan angka 0, barulah otoklaf dibuka. Pendinginan dilakukan sedikit demi sedikit. Bila medium mengandung vitamin, gelatin atau bangsa gula, maka setelah sterilisasi secepatnya medium tersebut segera didinginkan setelah dikeluarkan dari otoklaf. Hal ini untuk menghindarkan terurainya zat-zat tersebut. Medium yang steril dapat disimpan dalam almari es(Waluyo, 2010). Beberapa zat tertentu mempunyai ciri-ciri yang membuat tidak praktis untuk disterilkan dengan otoklaf. Bahan-bahan yang tidak bercampur dengan air, misalnya minyak dan lemak tidak tembus oleh uap air sehingga mikroorganisme yang terkandung di dalamnya akan tetap bertahan hidup. Selanjutnya bahan menjadi berubah atau rusak bila terkena suhu yang tinggi. Oleh karena itu, bahan- bahan tersebut perlu disterilkan dengan cara-cara sterilisasi yang lain (Waluyo, 2010). Otoklaf merupakan alat sterilisasi yang cukup menyakinkan walaupun demikian tidak dapat dipakai untuk mensterilkan alat-alat yang terbuat dari
- 8. plastik, karena bahanini akan meleleh. Demikian juga bila pengoperasiannya tidak tepat dapat menyebabkan ketidaktepatan dalam sterilisasi (Waluyo, 2010). 2.2 Pembuatan Media Medium adalah suatu bahan yang terdiri atas campuran nutrisi atau zat-zat hara (nutrien) yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme di atas atau di dalamnya (Waluyo, 2010). Media atau medium berfungsi untuk mengisolasi, menumbuhkan mikroorganisme, memperbanyak jumah,menguji sifat fisiologis dan menghitung jumlah mikroba. Dalam proses pembuatan medium harus disterilisasi dan menerapkan metode aseptis untuk menghindari kontaminasi pada medium(Yusdiani, dkk., 2016). Beberapa bakteri yang dibudidayakan di laboratorium dapat tumbuh dengan baik pada media apapun, ada juga bakteri yang memerlukan media khusus untuk memenuhi kebutuhan nutrisinya, dan ada juga bakteri yang masih belum bisa berkembang dan hidup di media budidaya. Sehingga untuk menumbuhkan suatu budidaya bakteri, harus diketahyui kriteria apa yang harus dipernuhi oleh medium budi daya(Turtora, et al., 1986). Media yang baik memiliki beberapa syarat berikut ini: 1) Mengandung semua unsur hara yang diperlukan untuk pertumbuhan dan pengembangbiakan mikroba 2) Mempunyai tekanan osmotik, tegangan permukaan pH yang sesaui dengan kebutuhan mikroba 3) Steril, sebelum ditanami mikroa tidak ditumbuhi oleh mikroba lain yang tidak diharapkan. (Yusdiani, dkk., 2016) Ada 2 medium yang dapat dibedakan berdasarkan komponen dasar yang membentuknya, yaitu medium yang tersusun dari bahan kimia tertentu dan medium kompleks (Yusdiani, dkk., 2016). Ketika media disiapkan untuk pertumbuhan mikroba, maka diberikan sumber energi, serta sumber karbon, nitrogen, sulfur, fosfor, dan faktor pertumbuhan yang diperlukan, yang tidak dapat disintesis organisme. Media tersebut merupakan media yang tersusun dari bahan kimia tertentu (Turtora, et al., 1986).
- 9. Sebagian besar bakteridan jamur heterotrofik ditanami di media kompleks. Media kompleks terdiri dari nutrisi seperti ekstrak dari ragi, daging sapi, atau tanaman, atau dari sumber lainnya. Pada media kompleks, dibutuhkan energi, karbon, nitrogen, dan sulfur sebagai persyaratan mikroorganisme tumbuh dipenuhi sebagian besar oleh protein. Protein adalah molekul besar yang relatif tidak larut sehingga hanya sedikit mikroorganisme yang dapat dimanfaatkan secara langsung. Tapi pencernaan sebagian oleh asam atau enzim mengurangi protein menjadi asam amino yang lebih pendek, yang disebut pepton – fragmen kecil yang dapat larut ini dicerna oleh bakteri (Turtora, et al., 1986). Vitamin dan faktor pertumbuhan organik lainnya disediakan oleh ekstrak daging atau ekstrak ragi. Vitamin dan mineral yang larut dari daging atau ragi dilarutkan dalam air ektraksi, yang kemudain diuapkan sehingga faktor ini terkonsentrasi. Ekstrak ragi sangat kaya akan vitamin B. Jika jenis media ini dalam bentuk cair, maka disebut kaldu nutrisi atau nutrient broth. Bila agar ditambahkan, maka disebut agar nutrisi atau nutrient agar (Turtora, et al., 1986). Dengan ada tidaknya bahan tambahan berupa zat pemadat (seperti agar dan gelatin) dikenal tiga bentuk media, yaitu media padat, semi padat atau semi cair, dan media cair. 1) Media padat. Media yang ditambah tepung agar sebanyak 12-15%. Media ini dapat dibedakan menjadi tiga jenis menurut bentuk dan wadahnya, yaitu media tegak, media miring, dan media lempeng. Metiga tegak menggunakan tabung reaksi yang ditegakkan sebagai wadahnya. Media miring menggunakan tabung reaksi yang dimiringkan. Media lempeng menggunakan cawan petri sebagai wadahnya. Media padat umumnya dipergunakan untuk bakteri, ragi, jamur, dan terkadang juga mikroalga (Yusdiani, dkk., 2016) 2) Media semi padat atau semi cair. Media yang mengandung agar kurang lebih 0,3 – 0,4 %, sehingga media menjadi lebih kenyal, tidak padat, dan tidak begitu cair. Umumnya digunakan untuk pertumbuhan mikoba yang banyka memerlukan kandungan air dan hidup anaerob atau fakultatif (Yusdiani, dkk., 2016) 3) Media cair. Secara umum medium cari adalah medium yang berbentuk cair karena tidak ada penambahan zat pemadat. Medium cari dapat digunakan
- 10. untuk berbagai tujuanseperti pembiakan mikroba dalam jumlah besar, penelaahan fermentasi, dan berbagai macam uji (Waluyo, 2010). Dalam prakteknya, pembuatan media sangat disederhanakan dengan tersedianya campuran yang disiapkan secar komersial yang mengandung bahan- bahan yang dieprlukan untuk pertumbuhan bakteri atau jamur dalam proporsi yang tepat (Smith, 1961). 2.3 Teknik Inokulasi Sebelum mulai membiakan mikroba, pertama-tama kita harus mempertimbangkan bagaimana cara menghindari kontaminan. Teknik yang digunakan dalam pencegahan kontaminasi selama membuat dan mensterilkan medium kultur disebut teknik aseptik. Penguasaan teknik ini diperlukan dalam keberhasilan laboratorium mikrobiologi dan hal tersebut merupakan salah satu metode permulaan yang dipelajari oleh ahli mikrobiologi pemula (Kusnadi, dkk., 2003). Kontaminan asal udara sering terdapat dalam medium, karena udara selalu mengandung partikel debu tempat komunitas mikroba. Transfer aseptik suatu biakan dari satu tabung medium ke tabung lainnya biasa dilakukan dengan menggunakan jarum inokulasi atau ose yang disterilkan dengan cara membakar di atas api. Biakan juga dapat dipindahkan dari permukaan lempeng agar, sebagai tempat perkembangan koloni dimana sel mengalami pertumbuhan dan pembelahan. Metode utama yang digunakan untuk memperoleh kultur murni dari komunitas mikroba yang mengandung beberapa mikroba yang berbeda dilakukan dengan memilih koloni-koloni yang terpisah dan menggoreskan pada lempeng agar dengan metode gores, sehingga diperoleh koloni mikroba yang murni (Kusnadi, dkk., 2003). Inokulasi adalah transfer mikroba ke media pertumbuhan yang telah disterilisasi sebelumnya. Jarum inokulasi bulat atau berbentuk jarum, yang terbuat dari kawat baja stainless, merupakan alat yang digunakan untuk inokulasi bakteri pada media dan juga beberapa prosedur mikrobiologi lainnya. Seteleh media diinokulasi, ditempatkan dalam inkubator, biasanya selama 24 – 48 jam. Selama
- 11. waktu tersebut, bakterisecara aktif tumbuh dan berreproduksi (Tortora, et.al., 1986). Jika kultur yang cukup encer diinokulasi ke media padat, mikroorganisme yang tumbuh dari masing-masing sel dalam bentuk sampel asli membentuk rumpum, atau massa yang dapat terlihat oleh mata. Rumpun bakteri yang tumbuh tersebut disebut koloni. Koloni memiliki karakteristik seperti tekstur, ukuran, bentuk, warna dan kepatuhan pada medium. Karakteristik seperti itu cukup konstan untuk setiap spesies dan berguna untuk membedakan satu mikroba dengan mikroba lainnya (Tortora, et.al., 1986). Isolasi mikroba adalah memisahkan mikroba satu dengan mikroba lain yang berasal dari campuran berbagai mikroba (Waluyo, 2010). Ahli mikrobiologi menggunakan beberapa prosedur untuk mengisolasi dan menumbuhkan koloni dari mikroorganisme, yaitu: 1) Metode cawan tuang Penggunaan media padat membuat isolasi bakteri dalam kultur murni . dalam metode ini, pengenceran bakteri yang tersuspensi dengan cairan dicampur dengan nutrient agar yang belum memadat.Kemudian agar-agar dituangkan ke dalam piring Petri, didinginkan sampai mengeras, dan diinkubasi. Dalam tuang piring tersebut, bakteri individu tumbuh menjadi koloni di bawah dan di permukaan agar. 2) Metode cawan sebar Dengan metode alternatif untuk mengisolasi koloni bakteri, suspensi bakteri diencerkan dengan cairan dan kemudian disebarkan pada media agar-agar nutrisi. Metode ini jugadisebut metode spread plate. Batang kaca bengkok yang telah disterilkan merupakan alat yang digunakan untuk menyebarkan bakteri pada media. 3) Metode cawan gores Metode isolasi yang paling umum digunakan adalah metode cawan gores. Jarum inokulasi steril dicelupkan ke dalam kultur campuran dan digores dengan pola tertentu di atas permukaan media nutrisi. Karena pola itu dilacak, bakteri digosok dari jarum ke medium, di jalur sel yang semakin sedikit (Tortora, et.al., 1986).
- 12. BAB III METODOLOGI PERCOBAAN 3.1Alat - Batang pengaduk - Batang L - Beaker glass Pyrex 250 ml - Cawan petri - Erlenmeyer Pyrex 250 ml - Gelas ukur - Inkubator - Jarum Ose - LAC - Lampu bunsen - Lemari pendingin - Kain kasa steril - Kapas - Kertas perkamen kajang - Kompor gas - Oven - Pipet mikro - Pipet tetes - Tali (benang bola) - Timbangan digital 3.2 Bahan - Aquadest - Etanol 70% - Biakan bakteri - Nutrient Agar (NA) - Nutrient Broth (NB) - Brillian Green Lactose Broth (BGLB)
- 13. 3.3 Flowsheet 3.3.1 SterilisasiAlat Dibungkus alat-alat gelas dengan kertas perkamen Diatur pengatur suhu oven menjadi 180°C dan disterilkan selama 2-3 jam. Atau jika menggunakan autoklaf disterilkan pada suhu 121°C selama 15 menit. Dikeluarkan alat-alat yang telah disterilisasi dari oven/autoklaf 3.3.2 Pembuatan Media a. Pembuatan Media NA Ditimbang 7 gram nutrient agar Dilarutkan ke dalam 250 ml aquadest di dalam erlenmeyer Dipanaskan di atas kompor sambil diaduk sampai larutan media menjadi bening Didinginkan Disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121̊C selama 15 menit Media yang telah disterilkan, didinginkan hingga suhu kamar kemudian dapat digunakan sesuai kebutuhan Media yang telah disterilkan bila tidak digunakan disimpan di dalam lemari pendingin Serbuk Nutrient Agar Alat-alat gelas Alat-alat steril
- 14. b. Pembuatan MediaNB Ditimbang 3,25 gram nutrient broth Dilarutkan ke dalam 250 ml aquadest di dalam erlenmeyer Dipanaskan di atas kompor sambil diaduk sampai larutan media menjadi bening Didinginkan Disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit Media yang telah disterilkan, didinginkan hingga suhu kamar kemudian dapat digunakan sesuai kebutuhan Media yang telah disterilkan bila tidak digunakan disimpan di dalam lemari pendingin c. Pembuatan Media Brillian Green Lactose Broth (BGLB) Ditimbang 10 gram nutrient agar Dilarutkan ke dalam 250 ml aquadest di dalam erlenmeyer Dipanaskan di atas kompor sambil diaduk sampai larutan media menjadi bening Didinginkan Media Nutrient Agar Serbuk Nutrient Broth Media Nutrient Broth Serbuk BGLB
- 15. Disterilkan di dalamautoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit Media yang telah disterilkan, didinginkan hingga suhu kamar kemudian dapat digunakan sesuai kebutuhan Media yang telah disterilkan bila tidak digunakan disimpan di dalam lemari pendingin 3.3.3 Teknik Inokulasi a. Metode gores Dibagi cawan petri menjadi 4 kuadran Dipanaskan jarum ose menggunakan api bunsen Diambil bakteri dari media lama menggunakan jarum ose Digores jarum ose ke media pada kuadran 1 secara sinambung sampai kuadran 4 Diinkubasi bakteri di dalam inkubator pada suhu 35 ± 2°C Diamati pertumbuhan bakteri pada media b. Metode sebar Dimasukkan media NA ke dalam cawan petri steril dan dibiarkan media memadat Media BGLB Cawan Petri Biakan bakteri Cawan Petri
- 16. Diteteskan 0,1 mlbiakan bakteri di permukaan agar yang telah memadat secara aseptis Dibakar batang L atau spreader yang sebelumnya telah dicelupkan di dalam alkohol, dibiarkan dingin Disebarkan bakteri dengan menggunakan batang L secara merata Diinkubasi bakteri di dalam inkubator pada suhu 35 ± 2°C Diamati pertumbuhan bakteri pada media c. Metode tabur Diteteskan 0,1 ml biakan bakteri ke dalam cawan petri yang steril secara aseptis Dituangkan 9 ml media NA yang belum Dihomogenkan biakan bakteri dan media NA dengan digoyangkan membentuk angka 8 Dibiarkan media NA memadat diinkubasi Diinkubasi bakteri di dalam inkubator pada suhu 35 ± 2°C Diamati pertumbuhan bakteri pada media Biakan bakteri Cawan Petri Biakan bakteri
- 17. BAB IV HASIL DANPEMBAHASAN 4.1 Hasil 4.1.1 Sterilisasi Alat dan Bahan No. Nama Alat Metode Sterilisasi Suhu dan Waktu 1 Cawan Petri Sterilisasi panas kering Suhu 170°C, 1 jam 2 Erlenmeyer Sterilisasi panas kering Suhu 170°C, 1 jam 5 Pipet tetes Sterilisasi panas basah Suhu 121°C, 15 menit 6 Media NA Sterilisasi panas basah Suhu 121°C, 15 menit 7 Media NB Sterilisasi panas basah Suhu 121°C, 15 menit 8 Batang L Sterilisasi dengan alkohol 9 Objek glass Sterilisasi dengan alkohol 10 Jarum Ose Sterilisasi dengan bunsen 4.1.2 Pembuatan Media No. Nama Bahan formula Metode Sterilisasi Suhu dan Waktu 1 Brillian Green Lactose Agar 10 g serbuk BGLB + Aquadest Sterilisasi basah Suhu 121°C, 15 menit 2 Potato Dextrose Agar 9,75 g serbuk PDA + Aquadest Sterilisasi panas basah Suhu 121°C, 15 menit 3 Plate Count Agar 4,375 g serbuk PCA + Aquadest Sterilisasi panas basah Suhu 121°C, 15 menit 4 Nutrien Agar 7 g serbuk NA + Aquadest Sterilisasi panas basah Suhu 121°C, 15 menit 5 Brilian Green Agar 13 g serbuk BGA + Aquadest Sterilisasi panas basah Suhu 121°C, 15 menit 6 MacKonkey Broth 8,75 g serbuk MCB + Aquadest Sterilisasi panas basah Suhu 121°C, 15 menit
- 18. 7 Lysine IronAgar 8 g serbuk LIA + Aquadest Sterilisasi panas basah Suhu 121°C, 15 menit 4.1.3 Teknik Inokulasi No. Metode Inokulasi Jenis Media yang Digunakan Jenis Biakan yang Digunakan Adanya Koloni (Ya/Tidak) Spesifikasi 1 Metode gores Nutrient Agar Bakteri Staphylococcus aureus Ya, terdapat pada bagian yang digoreskan 2 Metode tuang Nutrient Agar Bakteri Staphylococcus aureus Ya, tersebar merata pada media NA 3 Metode sebar Nutrient Agar Bakteri Staphylococcus aureus Ya, tersebar merata pada permukaan media NA 4.2 Pembahasan Pada praktikum ini, kami melakukan sterilisasi secara fisik yang menggunakan panas dari autoklaf dan oven. Alat yang kami sterilisasi ialah cawan petri, pipet ukur, dan media tumbuh NA dan NB di dalam erlenmeyer. Sebelum disterilkan, alat dan bahan tersebut dibungkus terlebih dahulu dengan kertas perkamen dan bagian mulut dari erlenmeyer ditutup dengan kapas yang dibungkus kain kasa. Hal ini dilakukan untuk menghindari dan mencegah masuknya kembali bakteri setelah disterilisasi, dan menjaga sterilitasnya (Burrows, 1959). Setelah dibungkus, alat dan bahan kemudian dimasukkan ke dalam autoklaf dan oven. Cawan petri, erlenmeyer, dan beaker glass disterilisasi di dalam oven, karena alat-alat tersebut tahan terhadap suhu yang tinggi. Sedangkan pipet tetes, gelas ukur, dan media tumbuh disterilisasi di dalam autoklaf. Sterilisasi pada oven dilakukan pada suhu 170°C selama 1 jam, sedangkan pada autoklaf dilakukan ada suhu 121°C selama 15 menit. Penghitungan waktu sterilisasi dimulai semenjak termometer pada otokIaf atau oven menunjuk 121°C dan 170°C.
- 19. Pada percobaan selanjutnya,kami membuat media Nutrient Agar (NA), media Nutrient Broth (NB) dan media Brillian Green Lactose Broth (BGLB). Media NA dan media NB memiliki kandungan yang sama, yakni ekstrak daging (beef extract), pepton, dan agar. Namun berbeda pada konsistensinya, media NA berbentuk padat, sedangkan Media NB berbentuk cairan. Pada pembuatan media, kami menggunakan 7 gram serbuk NA sintetis, 3,25 g gram serbuk NB sintetis, dan 10 gram serbuk BGLB sintetis, yang masing- masingnya dilarutkan ke dalam 250 ml air di dalam erlenmeyer. Kemudian ketiga larutan medium tersebut dihomogenkan dengan cara diaduk dan dipanaskan diatas kompor gas. Pemanasan dihentikan sampai terbentuknya buih dan larutan media berubah warna dari keruh menjadi bening. Kemudian mulut erlenmeyer disumbat dengan kapas yang dibungkus oleh kain kasa agar larutan media tidak meluap ataupun menguap. Setelah itu larutan media disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit. Seteleh media steril, media didinginkan sebelum digunakan. Setelah itu media dapat dituang ke dalam cawan petri atau ke dalam tabung reaski sesuai kebutuhannya. Media yang dituang hendaknya tidak terlalu panas, agar tidak terbentuk uap air pada tutup cawan petri sehingga dapat mengganggu proses pengamatan. Pada percobaan terakhir, kami melakukan pembiakan bakteri dari media lama ke media baru. Metode yang kami gunakan adalah hanya menggunakan 3 metode inokulasi yaitu metode gores, metode sebar, dan metode tuang. Pada percobaan ini, kami menggunakan bakteri Staphylococcus aureus dan media NA sebagai media pertumbuhannya. Setelah media NA siap dan tidak terlalu panas, media dituangkan dan dibiarkan memadat. Namun pada metode tuang, sebelum media NA dituang, 0,1 ml bakteri terlebih dahulu diteteskan menggunakan pipet mikro ke dalam cawan petri yang steril. Hal itu dilakukan agar bakteri yang ditumbuhkan dapat tumbuh tersebar pada media NA. Kemudian cawan tersebut dituangkan media NA dan dihomogenkan dengan gerakan memutar cawan membentuk angka 8. Pada metode goresan, kami menggunakan teknik goresan kuadran. Bakteri diambil menggunakan jarum ose bulat yang telah disterilkan, kemudian
- 20. digoreskan pada permukaanNA secara zig-zag sinambung. Pada metode sebar, pada media yang telah padat dimasukkan 0,1 ml suspensi bakteri. Bakteri disebar ke seluruh permukaan media menggunakan batang L yang telah disterilikan menggunakan bunsen api. Hasil pengamatan setelah biakan bakteri diinkubasi, media yang menggunakan cara sebar ditumbuhi koloni bakteri yang tersebar di permukaan media NA. Pada metode gores, koloni bakteri tumbuh disekitar goresan dan koloni yang tumbuh semakin sedikit dari goresan pada kuadran pertama sampai kuadran keempat. Pada metode tuang, koloni bakteri tumbuh pada media NA secara keseluruhan baik di dalam media maupun dipermukaannya.
- 21. BAB V KESIMPULAN DANSARAN 5.1 Kesimpulan - Sterilisasi kering dilakukan di oven pada suhu 170°C selama 1 jam. Alat- alat yang disterilisasikan adalah alat-alat bukan alat ukur dan tahan pemanasan tinggi, seperti cawan petri, beker gelas, tabung reaksi. - Sterilisasi panas basah menggunakan autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit. Alat alat yang disterilisasi menggunakan autoklaf adalah pipet tetes, erlenmeyer, gelas ukur, dan media. - Pembuatan media NA menggunakan 7 g serbuk media NA + 250 ml aquadest. Pembuatan media NB menggunakan 3,25 g serbuk media NB + 250 ml aquadest. Pembuatan media BGLB menggunakan 10 g serbuk BGLB + 250 ml aquadest. - Inokulasi bakteri menggunakan metode sebar dan gores memerlukan media yang telah padat, kemudian bakteri dapat digores atau disebar di permukaan media. Sedangkan inokulasi metode tuang, dilakukan dengan memasukkan terlebih dahulu bakteri kemudian ditambahkan media lalu dihomogenkan. 5.2 Saran - Sebaiknya membuka alat yang telah disterilkan dilakukan di dalam LAC agar dapat memperkecil kemungkinan terkontaminasinya kembali alat atau media. - Sebaiknya pada percobaan berikutnya dibuat medai yang lain seperti PCA, PDA, dan lain-lain. - Sebaiknya pada percobaan selanjutnya digunakan inokulum lain seperti Escherichia coli, Micrococcus sp., dan lain-lain. - Sebaiknya gunakan masker dan sarung tangan pada saat inokulasi bakteri.
- 22. DAFTAR PUSTAKA Burrows, William.1959. Textbook of MICROBIOLOGY. Philadelphia: W. B. Saunders Company Elrod, Susan L. Dan Stansfield. 2007. Genetika Edisi Keempat. Jakarta: Erlangga Kusnadi, dkk.. 2003. Mikrobiologi. Bandung: FPMIPA Universitas Pendidikan Indonesia Raudah, dkk.. 2017. Efektivitas Sterilisasi Metode Panas Kering Pada Alat Medis Ruang Perawatan Luka Rumah Sakit Dr. H Soemarno Sosroatmodjo Kuda Kapuas. Banjar Baru: Jurnal Kesehatan Lingkungan. Vol. 14. No.1: 425-430 Rutala, William A., and David J. Weber. 2008. Guideline for Disenfection and Sterilization in Healthcare Facilitie. (https://www.cdc.gov/infectioncontrol/guidelines/disenfection) Tortora, Gerard J., Berdell R. Funke, and Christine L. Case. 1986. Microbiology An Introduction. California: The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. Waluyo, Lud. 2010. Teknik dan Metode Dasar Dalam Mikrobiologi.Malang : UPT Penerbitan Universitas Muhammadiyah Malang. Yusdiani, Devita, dkk.. 2016. Bakteriologi Bidang Keahlian Kesehatan untuk SMK/MAK. Jakarta: ECG
- 23. Medan, 05 Maret2018 Asisten Lab Praktikan Aldo Josua Simanjorang Kelompok 1
- 24. LAMPIRAN Gambar alat sterilisasi.a. Autoklaf, b. oven. Gambar pembuatan media. a. Menghomogenkan dan pemanasan media. b. Sterilisasi media a b a b
- 25. inkubasi biakan bakteridi dalam inkubator Bakteri setelah diinkubasi selama 15 jam a b c